一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法发明专利.docxVIP

一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法 技术领域 本发明涉及蛋白修饰技术领域，具体的更涉及一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法。 背景技术 随着生物技术的飞跃发展，越来越多的重组蛋白质药物被成功应用到人类疾病的治疗中。重组人粒细胞刺激因子(recombinant human granulocyte colony stimulatingfactor,rhG-CSF)是非常成功的基因工程药物。人粒细胞刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)由单核细胞及成纤维细胞产生，可刺激粒细胞集落形成，对中性粒细胞有刺激作用，常被用于接受放/化疗的癌症患者及骨髓移植后白血病患者的辅助治疗，Amgen公司1991年获得FDA批准上市，但由于rhG-CSF较短的体内半衰期、容易产生免疫原性反应等，在临床使用中受到了很大限制。为了解决这些问题，改善其在人体内的药代动力学，Amgen公司利用聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)修饰技术对G-CSF进行了修饰，延长了其体内半衰期，提高生物利用度，PEG-rhG-CSF于2002年获得FDA批准上市，取得了很好的临床效果和巨大的经济效益。 聚乙二醇化修饰可通过多种方法与蛋白质相连接，如通过与蛋白质表面的氨基(如赖氨酸的ε-氨基或N-末端上的氨基)、巯基、羟基、羧基等反应而连接到蛋白质上。目前采用较多方法是利用还原性烷基化反应将聚乙二醇醛衍生物定点偶联到蛋白质的N-末端氨基上，首先PEG衍生物的醛基跟蛋白质N-末端氨基生成亚胺(席夫碱)，然后再被催化剂还原成胺，从而将PEG连接到蛋白质上，此方法可保证产品的均一性和稳定性。通常此烷基化反应在弱酸条件下进行，氰基硼氢化钠常被用作催化剂，PEG化修饰蛋白质产率高，被大家广泛应用。 通常此聚乙二醇化修饰反应在弱酸条件下进行，反应中采用氰基硼氢化钠，但氰基硼氢化钠是剧毒物质，保存条件严格，且在反应中最终生产氢氰酸和硼氢化钠，造成产品安全性存在巨大风险，因此为了保证用药安全和用药成本，研究替代氰基硼氢化钠来完成蛋白质的PEG化修饰的制备方法将产生较大的社会价值。 发明内容 除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。如果现有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不一致，则以本申请中提供的术语定义为准。 本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。本发明中未提及的组分的来源均为市售。 本发明人通过在反应体系中添加特定的维生素和/或辅酶，尤其是NADPH，并且使其在适量的无机盐的存在下来进行rhG-CSF的PEG化修饰，反应条件温和，反应后生成NADP+，无有害物质生成，同时该制备方法聚乙二醇修饰产率较高，简化了修饰反应终止工艺，大大降低商业化生产成本。 本发明第一个方面提供了一种蛋白质定点聚乙二醇化修饰的制备方法，在维生素和/或辅酶存在下，使相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD-40kD的聚乙二醇衍生物与蛋白质进行反应。 在本发明，适合本发明的方法的蛋白质优选重组人粒细胞刺激因子(recombinanthuman granulocyte colony stimulating factor,rhG-CSF)，是非常成功的基因工程药物。 在一些实施方式中，优选聚乙二醇衍生物选自PEG琥珀酰亚胺碳酸酯、PEG对硝基苯碳酸酯、PEG琥珀酰亚胺琥珀酸酯、PEG碳酰咪唑、PEG苯并三唑碳酸酯、PEG苯基琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧聚乙二醇羟琥珀酰酯乙酸酯、甲氧聚乙二醇醛如甲氧聚乙二醇丙醛、甲氧聚乙二醇丁醛、聚乙二醇巯基中的至少一种。 为了使修饰后的蛋白在体内具有更好的长效缓释性，优选使用甲氧聚乙二醇醛，该甲氧聚乙二醇醛的分子量为5kD-40kD，可以是单一分子量，也可以是不同分子量的至少一种甲氧聚乙二醇醛混合而成的。更优选的，所述甲氧聚乙二醇醛为甲氧聚乙二醇丙醛，可以是单一分子量的甲氧聚乙二醇丙醛，也可以是不同分子量的甲氧聚乙二醇丙醛混合而成，其中，优选以相对于蛋白质质量的3～7倍量的5kD-40kD的聚乙二醇衍生物进行投料，更优选5倍量。在生物化学、分子生物学和蛋白组学中经常用D或KD，蛋白质是大分子，所以常用kDa(千道尔顿)来表示。 甲氧聚乙二醇丙醛分子量太大，反应较慢，而且在对蛋白质修饰时分子量大的甲氧聚乙二醇丙醛容易包覆在蛋白质表面使其在生物体内难以释放，分子量