DNA重组常见问题TaKaRa的内切酶和NEB的内切酶哪个更好一些.pdfVIP

DNA重组常见问题 TaKaRa 的内切酶和 NEB的内切酶哪个更好一些？ 参考见解： TaKaRa 的内切酶、 NEB的内切酶两个公司的酶的品质都非常好。 NEB公司的酶 的活性很高，切出两条小带可能是因为出现星活性，可以试试把酶量减半。 NEB的酶很多都 是克隆的，所以纯度比较高。 应用磁性微球提取人全血基因组 DNA，将提取出的 DNA直接用于限制性酶切反应， 应用 Taq1 酶，但发现酶切后产生的是 smier 片断，即切碎的状态。不知原因是什么？在做这类实验 时，一般是将 PCR产物进行酶切，这与实验结果有联系吗？是不是直接提取出的 DNA必须 要做 PCR扩增，才能应用酶切？ 参考见解： 1. 为建立基因组文库时一般才用限制性内切酶酶切人基因组 DNA.目的是为获得含有人全 部 DNA的随机片段的总和 . 然后再用载体和宿主细胞构建克隆 . 关于文库建立园内资料很 多.lyz703lyz 战友感兴趣的话可以自己搜索下 . 2. 电泳图 , 酶切后是一片弥散的带 , 是因为基因组中存在大量 Taq1 酶的酶切位点 , 由于操作 属于随机酶切 , 所以得到的 DNA也是随机的 , 而不是大量均一的 . 那么电泳后的出现这样的结 果也很容易解释 . 3. 一般在 PCR后采用酶切是由于酶切模板数目巨大且均一 , 在了解了被切 DNA上有关限制性 内切酶位点的信息后 , 我们就可以根据自己的目的来选择合适的内切酶进行酶切 . 做抑制差减杂交 , 需要回收细菌基因组酶切 (Alu1 酶 ) 后的全部片段 , 要求回收后至少是 6 微 升, 浓度要有 0.3 微克 微升 , 按照抑制差减杂交说明书 , 采用酚仿抽提和无水乙醇沉淀法 , 只 要酶切 2 微克基因组就能满足条件 , 可已经把酶切量扩大到 10 多微克了 , 回收还是达不到浓 度( 大约只有 0.06 微克 微升 ), 又不敢切胶回收 , 怕 EB对后续反应造成影响。请教该怎么 办？ 参考见解：回收酶切产物浓度低的原因可能是：苯酚 / 氯仿抽提时损失太多。说明书上说苯 酚/ 氯仿 / 异戊醇和氯仿各抽提两次，这样经过四次抽提 DNA损失得非常多，解决办法是将 50?l 酶切产物加等体积的灭菌去离子水，然后再抽提，损失会减少很多；另外乙醇沉淀时 可以延长，低温沉淀会提高得率；还有用 80 ％乙醇洗涤沉淀弃上清时，要轻轻用移液枪吸 出，防止将沉淀随上清倒出。注意这几点应该可以回收到理想浓度的 DNA了。 做 PCR将分别将 50 和 300bp 片段扩出后，将两个片段连接到一起为 550bp，要将 550bp 片 段连到载体上，但 550bp 片段中间产生了新的酶切位点跟设计的酶切位点 AseI 一样，想通 过部分酶切方法得到 550 的片段，如果完全酶切就分成原来的两个片段，求教部分酶切的 详细方法？ 参考见解：可以选择那个和设计不相同的那一端的酶切位点先做连接， 之后再进行平化连接， 这样就可以避免所设计中的有重复酶切位点的问题了。 部分酶切关键是酶切时间， 可以先摸 索一下酶切的时间。在一个大一点的体系中（比如 50 微升体系）， 37 度酶切，然后每隔一 段时间取