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体外哺乳细胞微核试验 检测方针草案 2007年12月13日,(第三版) 化学物检测的OECD方针 新方针487草案: 体外哺乳细胞微核试验 引言 1. 体外微核试验是通过检测分裂期间细胞质中微核的遗传毒性试验。微核可能来源 于无着丝粒染色体片段(也就是缺少着丝粒)，或者是那些无法在细胞分裂后期迁 移至两极的整条染色体。此实验可检测那些暴露于受试物或是暴露之后经历细胞 分裂的细胞中致使染色体断裂和染色体加倍的化学物(1)(2)毒性。试验指导准 许添加或是不添加肌动蛋白聚合反应抑制剂细胞松弛素B的协议(cytoB)。添加 cytoB有利于使细胞处于有丝分裂期，由于这些细胞都是双核的(3)(4)，所以在 那些已经完成一个细胞分裂周期的细胞中可以鉴别和选择性分析微核率。 2. 除了利用微核试验来鉴别那些能诱导产生微核的化学物，还可利用一种胞质分裂 阻断技术，着丝粒免疫化学标记，或是着丝粒/末端着丝粒探针杂交技术(荧光原 位杂交技术，FISH)，这些也可提供关于染色体损伤机制和微核形成方面的信息。 这份试验指导也准许不添加胞质分裂阻断剂协议的使用，但是要通过细胞数目分 析证实细胞已完成了有丝分裂。当微核形成增加，而且研究者希望检测是否这样 的增加是由于染色体断裂和/或是染色体加倍引起的时候可以利用标记和杂交技 术。 3. 微核所反映的损伤是本应该被迁移至子细胞的染色体由于在细胞分裂中期滞留所 形成染色体畸变获得的。由于能够相对客观的评价细胞分裂中期的微核，所以实 验员只需检测是否细胞经历了有丝分裂，多少细胞含有微核。所以，能够相对较 快的准备工作，自动分析。这使每次处理获得数千的而非数百的细胞变得实用， 增加了试验效率。最后，微核可能由滞后的染色体形成，存在潜在的检测非整倍 性诱导引起的染色体畸变，所以这使常规染色体畸变研究变得困难。例如，OECD 试验指导473(17)。不管怎样，微核试验不能用于多倍体的鉴别。 4. 微核试验是一种利用体外培养人或啮齿类动物细胞方法。这种方法可同时检测染 色体断裂剂和非整倍体毒剂引起的畸变，所以为在体外研究染色体损伤提供了广 泛依据。 5. 无论是存在或是缺少cytoB的情况下，微核试验在种种细胞试验类型中都是安全 有效的。有大量资料用不同的细胞系(CHO, V79, CHL, and L5178Y)和人体淋巴 细胞(18)(19)(20)(21)(22)(23)(24)(25)(26)(27)(28)(29)(30)(31)来证明微核试验的有 效性。这些包括，尤其是国际效度研究联合Société Fran?aise de Toxicologie Génétique (SFTG) (18)(19)(20)(21)(22) 和关于遗传毒性(4)(16) 检测国际研讨会。 现有数据通过欧洲委员会欧盟替代方法验证中心提供的大量原始效度研究论据已 经被重新评价，并且这种试验方法被ECVAM Scientific Advisory Committee (ESAC) (32)(33)认可为科学有效的。虽然使用过TK6 淋巴母细胞细胞系(34)和人类HepG2 细胞 (35)(36)，但是还没有在效度研究中印证。 6. 附录1提供定义 初步考虑 7. 体外试验中，除了细胞关于受试物有代谢活性外，通常是需要使用代谢活化的外源物。 外源代谢活化系统并不完全模拟体内的条件。应注意避免引起不能反映本质诱变的人 为阳性结果的条件，或者避免引起酸碱度，渗透压的显著变化及高水平的细胞毒性 (37)(38)(39)等因素。 8. 在分析微核诱导中，至关重要的是发生在处理和非处理培养物中核的分裂。最佳获得 微核的阶段是在细胞接受受试物处理时或之后，完成一个有丝分裂期周期时。 试验原理 9. 除非细胞有足够的代谢能力，通常条件下，人体或啮齿类动物细胞培养暴露在添加或 不添加代谢活化外源物的受试物下。同时溶剂/空白和阳性对照都包含在所有的试验 中。 10. 对接受受试物暴露时或暴露后，细胞生长一段时间足以使染色体或纺锤体损伤，而导 致在间期细胞中微核的形成。对于非整倍体的诱导,受试物应该只作用于有丝分裂期 间。为了分析微核，收获分裂间期细胞和然后染色。理想的情况是,微核应当只存在于 那些在受试物暴露下或是暴露后的细胞中。在经胞质分裂阻断剂处理的培养物中,只有 双核的细胞。在缺少胞质分裂阻断剂时,重要的是，对于受试物，被分析的细胞在接受 暴露和暴露后可能已经完成细胞有丝分裂。对于所有的协议,必须说明的是:对照组和 试验组都要经过细胞增殖，在获得微核培养物时，要对受试物引能起细胞毒性和细胞 生长抑制性的浓度范围做个估测。 方法描述 准备 细胞 11. 能使用培养的原代人体外周血淋巴细胞 (5)(1