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细胞凋亡实验会计学第2页/共27页二、细胞坏死与凋亡的比较 坏死 凋亡 性质病理性、非特异性生理性或病理性，特异性 诱导因素强烈刺激，随机发生较弱刺激，非随机发生 生化特点被动过程，无新蛋白质合成，不耗能主动过程，有新蛋白质合成，耗能 DNA电泳 形态变化弥散性降解，电泳呈均一DNA片状细胞结构全面溶解、破坏、细胞肿胀DNA片段化（180—200 bp），电泳呈“梯”状条带胞膜及细胞器相对完整细胞皱缩，核固缩 炎症反应溶酶体破裂，局部炎症反应溶酶体相对完整，局部无炎症反应 凋亡小体无有 基因调控无有第3页/共27页三、细胞凋亡的生理意义1. 确保正常发育、生长 如：指（趾）间隙的形成2. 维持内环境稳定 如：清除受损、突变或衰老的细胞3.发挥防御功能 如：使受到病毒感染的细胞凋亡第4页/共27页四、凋亡时细胞的主要变化（一）形态学改变初期：细胞变圆微绒毛消失胞质浓缩空泡化核染色质高度浓缩凝集在核周边,边集细胞体积缩小中期：凋亡小体 胞膜内陷出芽浓缩核裂解膜自行分割后期：邻近的上皮细胞、MΦ、瘤细胞等吞噬凋亡小体第5页/共27页Normal Cell Apoptotic cell 第6页/共27页（二）、生化改变 １、DNA片段化－主要特征 2、内源性核酸内切酶（Ｄnase)激活 3、凋亡蛋白酶（Caspases）激活　第7页/共27页 内源性核酸内切酶的作用180-200 bp内源性核酸内切酶H1Zn2+Ca2+ Mg2+核心颗粒连接区第8页/共27页五、细胞凋亡的检测方法1、形态学检测（一） HE染色（凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状）（二）透射电镜观察（三）荧光显微镜观察 第9页/共27页透射电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 第10页/共27页荧光显微镜 ?Ⅰ期的细胞核呈波纹状(rippled)或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态;Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1）第11页/共27页2、DNA片断化检测 细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300 kbp长的DNA大片段, 或180~200 bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成第12页/共27页第13页/共27页3、流式细胞仪检测 flow cytometer（一）PI 单染 （二）Annexinⅴ/ PI双染色第14页/共27页（一） PI 单染 荧光染料PI（碘化丙啶）是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测，英文全称是Propidium Iodide。它是一种溴化乙啶的类似物，在嵌入双链DNA后释放红色荧光。细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。 AB第15页/共27页判断：在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。（检测晚期凋亡，但不能判断是晚期凋亡还是坏死） 第16页/共27页（二）Annexinⅴ/PI双染色 原理：磷脂酰丝氨酸（PS）主要存在于细胞膜内侧，细胞凋亡时，它移向细胞外侧。可能是PS膜内外转位酶的早期激活有关。Annexinⅴ是一种Ca2＋依赖磷脂结合蛋白，对PS有高度亲和性。 PS外翻不是凋亡细胞所特有，坏死细胞也可发生。 两种细胞的区别在于早期凋亡细胞细胞膜是完整的，而坏死细胞膜完整性受到破坏, 可用PI区分。 第17页/共27页检测标准：早期凋亡细胞：Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (-)；坏死细胞和晚期凋亡继发性坏死细胞： Annexin ⅴ-FITC (+)；PI (+)；机械性坏死及非特异性染色： Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (+)；正常细胞：Annexin ⅴ-FITC (-)；PI (-)； 第18页/共27页凋亡结果坏死结果C-myc ASO200 nmol/L 第19页/