质粒DNA提取课件.pptVIP

小规模制备质粒DNA的技术分析 一、实验目的 ;二、 实验原理 ;细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1Kb-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身基因组DNA的同一组酶系。 ;严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成才会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。;载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。;抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。;Insert;三 .质粒提取的思路;DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。;质粒DNA的提取方法;;SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。 释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。 然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而基因组DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而基因组DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。;　　　　四、实验步骤;? 加入150uL溶液III（轻轻混匀），室温静置,冰上放置 5min，质粒DNA复性 ? 12000rpm，离心15min，将上清转至另一离心管中备用 ? 向上清中加入等体积氯仿/异戊醇（24:1）（去蛋白），反复混匀， ? 10000rpm，离心10min ，将上清转至另一离心管中备用 ? 向上清加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置15～20min ? 12000r/min离心 10 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。 ? 用500 μL 70% 乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。 ? 加入适量（30 μL）的TE其中含有20 ug/ml的RNA酶，使DNA完全溶解 ? －20℃保存。;☆原理示意图;相关原理;溶液I的作用 ;;;溶液II ;溶液II;溶液III ;溶液III;溶液III;酚/氯仿;酚/氯仿;乙醇;RNase;核酸电泳与感受态细胞的制备;1 琼脂糖凝胶电泳技术 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的 核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。;1.1 琼脂糖凝胶的特点;核酸相对分子量质量及分子构型 凝胶的浓度 1.2.1 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 DNA分子的大小在凝胶中，DNA片段迁移距离（迁移率）与碱基对的对数成反比，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。此时电泳的迁移率不再依赖于分子大小，因此，就用琼脂糖凝胶电泳分离DNA时，分子大小不宜超过此值。 ; 1.2.2、核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环DNA直线DNA开环的双链环状DNA。当琼脂糖浓度太高时，环状DNA（一般为球形）不能进入胶中，相对迁移率为0（Rm=0），而同等大小的直线双链DNA（刚性棒状）则可以长轴方向前（Rm0），由此可见，这三种构型的相对迁移率主要取决于凝胶浓度，但同时，也受到电流