RHOROCK通路在创伤性脑损伤后神经再生中作用机制.ppt

RHOROCK通路在创伤性脑损伤后神经再生中作用机制 主要内容 立论依据 研究目标、内容、方法 拟解决关键问题、可行性分析 创新点 研究进度、预期成果 经费预算、参考文献 立论依据 创伤性脑损伤（TBI）致死、致残率很高，给社会家庭造成巨大损失。 在美国每年约有1，700，000人遭受TBI，其中约52，000人死亡，直接和间接经济损失达600亿美元。我国每年约有10万人死于TBI，其中，因车祸死亡约5万人，这一数字也呈上升趋势。 立论依据 本课题为国家自然基金项目-“创伤性脑损伤的神经源性机制及其干预实验研究”的后续研究，着重讨论Rho/Rock通路在TBI后神经源性炎症和神经再生修复中的作用机制,探索新的干预措施，从新角度探求脑创伤后神经修复的新治疗策略和方案。 立论依据 本研究采用TBI大鼠模型，以脑组织内NF-κB等为神经源性炎症反应的指标，脑细胞线粒体、神经突触等超微结构变化为神经病理损伤指标，Nogo-A等为阻碍神经再生的指标，BDNF等为促进神经再生的指标，探究该通路在调控神经再生中的作用机制 立论依据 机制假设：TBI激发神经源性炎症，激活Rho/Rock通路，致球蛋白轻链磷酸化酶（MLCP）活性受抑制，引起脑血管平滑肌收缩，血流下降，内皮及屏障功能受损，导致脑组织缺血，阻碍神经再生，脑血管周围炎性物质渗出增加，引发血管性、细胞性脑水肿和脑细胞调亡。使用Rho激酶、NF-κB抑制剂和神经营养因子等干预措施，松弛血管平滑肌，扩张血管，促进脑组织血供，改善神经再生微环境,这为TBI的早期干预和康复治疗提供了新思路。 图1 Rho/Rock经典信号通路 Rho/Rock信号通路的成分主要有三个：小G蛋白(在这里主要是指Rho)、与Rho相连的Rho激酶(Rho-kinase)和Rho-kinase的效应分子[3-5]。 研究目标 （1）探讨Rho/ROCK信号通路在TBI后神经源性炎症中的作用机制； （2）研究Rho/ROCK信号通路在控TBI后中枢神经系统修复微环境的作用及其机制； （3）观察多种干预措施对Rho/ROCK信号通路的影响及其在治疗TBI中的应用价值。 （1）通过免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-κB、BDNF、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据； （2）通过分子生物学手段（如PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-κB、BDNF、NOGO-A等的基因表达水平。 （3）取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。 （4）观察干预措施（Rho激酶抑制剂）对上述（1）~（3）变化的影响； （5）上述几项中改变和变化的相关性分析。 研究内容 （1）未干预TBI组： 实验采用SD大白鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重270-290g，乌拉坦腹腔注射（1.2mg·kg-1）麻醉满意后，将大鼠固定在脑立体定位仪上（ST-T型，日本成贸公司）。制作TBI模型时沿正中线切开头皮并剥离骨膜,切口长2cm，暴露右顶骨，牙科台式电钻(宁波医疗器械厂)于冠状缝后1.5mm,中线右旁2.5mm处钻一直径为5mm的圆形骨窗,保持硬脑膜完整，将撞杆头端置骨窗处,击锤（重20g）沿外周导管分别从10cm、30cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶轻、中度脑挫伤,另用击锤（重40g）沿外周导管从25cm高处自由落下冲击撞杆,造成右顶叶重度脑挫伤,致伤冲击力分别为0.028N·s、0.048 N·s和0.088 N·s，硬膜保持完整，骨蜡封闭骨窗。TBI组按损伤程度分为轻、中、重三组。于伤后0.5、6、12、24、48、72h断头取血，开颅取脑，进行如下实验： 实验方法 ①免疫组化和电镜观测Rho、ROCK、NF-κB、神经营养因子、NOGO-A等在对照组（假手术组）及实验组（颅脑损伤动物模型组）SD大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及周边区脑组织中的分布特征和定位规律，以寻找组织学根据； ②通过分子生物学手段（PCR）测定对照组及实验组大鼠大脑皮层、下丘脑、垂体、脑干、损伤处及其周边脑细胞中Rho、ROCK、NF-κB、神经营养因子、NOGO-A、等的基因表达水平； ?取大鼠大脑中动脉（MCA）做Rho激酶活性、MLCP活性、MLCK活性及MLC磷酸化水平测定。 实验方法 （2）干预TBI组： 撞击鼠脑后使用Rho激酶抑制剂（Hydrochloride Fasudil、 Y-30141 ）、 NF-KB抑制剂-PDTC、神经营