CRISPR-Cas9基因编辑系统中两种gRNA活性检测方法比较.pdfVIP

肺血管病杂志2016年 7月第 35卷第7期 JournalofCardiovascular＆PulmonaryDiseases，July2016，Vo1．35，No．7 563 DOI：10．3969／j．issn．1007-5062．2016．07．018 基 础研 究 · CRISPR／Cas9基因编辑系统中两种 gRNA活性检测方法 比较 刘 燕 任卫红 王绿娅 张晓萍 高诗娟 武 威 李凤娟 杜 杰 [摘要] 目的：比较CRISPR／Cas9系统中gRNA活性检测的两种方法，即利用 Surveyor／T7E1核酸 酶检测方法或利用 Cas9蛋白的体外检测方法。方法：～方面构建表达 Cas9和特异 gRNA的质粒，转染 NIH3T3细胞 ，然后提取 DNA，利用 T／E1核酸内切酶检测 gRNA介导Cas9切割靶 DNA并产生 indel突 变的效率 ；另一方面，设计引物并利用PCR扩增出gRNA的DNA模板片段，通过体外转录获得gRNA，利 用Cas9蛋白及gRNA进行体外反应检测切割效率。结果：利用 Cas9蛋白体外酶切可以检测到较高