第4章 遗传基础和基因工程.ppt

遗传学方法---根据标记基因筛选 A)根据抗生素抗性基因筛选：含抗性基因的质粒转化后，细菌在含这种抗生素的培养基中培养时，未被转化的细菌即被杀死，能生长的就是成功转化的；对于带有抗生素抗性基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。 例：四环素抗性基因—tcr或tetr；卡那霉素抗性基因—knr或kanr；链霉素抗性基因—smr或strr；氯霉素酰基转移酶基因—cat或cmr B)根据报告基因筛选：荧光蛋白基因；萤火虫荧光素酶基因；?-葡萄糖酸苷酶基因。 重组体的筛选和鉴定 抗生素抗性标记基因筛选原理 C)根据标志互补进行筛选： 1) 转化进来的外源基因产物能够弥补受体株菌的突变缺陷型 受体菌his- 外源基因his+ 2) ?-互补：当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变，LacZ(?-半乳糖苷酶)基因表达蛋白失活，产生的氨基酸片段失去α-互补能力，含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。而没有重组质粒的转化子产生α-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。(蓝白筛选) 在不含组氨酸的培养基中生长 重组体的筛选和鉴定 1. 基因工程的工具酶 2. 基因工程的载体 三、基因工程的基本工具 一、限制酶(restriction enzyme)：限制性内切酶 酶的识别和切割位点：通常4-6bp，具有回文结构(palindrom)。 1. 基因工程的工具酶 1) 产生粘性末端(sticking end) 5＇-末端: EcoR 1: 5＇-G?AATTC-3＇ 3＇-CTTAA?G-5’ 3＇-末端: Pst1 : 5＇-CTGCA?G-3＇ 3‘ -G?ACGTC-5’ 2) 产生平末端(blunt end): Sma1: 5＇-CCC?GGG-3＇ 3＇-GGG?CCC-5 同功异源酶(isochizomers)：来源不同，识别和切割位点相同。 如：BamH 1 和 Bst 1 同尾酶(isoaudamers)：识别序列不同，但产生相同的粘性末端。 如：BamH 1 ： G?GATCC Sau3A 1： N?GATCN 基因工程的工具酶 二、修饰酶：对DNA 或RNA 末端进行剪切、补平、连接及化学修饰的酶。 1、DNA聚合酶 大肠杆菌中第一个发现，MW 109KD 还具有5‘?3’及3‘?5’外切酶活性 2、逆转录酶 (reverse transcriptase)：以RNA为模 板合成DNA，构建cDNA文库 3、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)：将3‘-OH 与5’-P 连接形成3’, 5’-磷酸二酯键 基因工程的工具酶 4、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）：去除DNA or RNA 5‘-P，制备载体时可防止载体自身连接， 提高重组效率。 5、末端脱氧核苷酰转移酶 末端转移酶 作用：在DNA的3＇-OH上，加上 dNTP 6、Taq DNA聚合酶 和其它耐热DNA聚合酶 PCR时 基因工程的工具酶 分子遗传学的发展揭示了遗传密码的秘密，使基因的概念落实到具体的物质上，即基因在DNA分子上，一个基因相当于DNA分子上的一定区段，它携带有特定的遗传信息。这类遗传信息或被转录为RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA；或者信使RNA被翻译成多肽链。 另一方面，在精细的微生物遗传分析中查明，基因并不是不可分割的最小单位，而是远为复杂得多的遗传和变异的单位。 二、生化遗传和早期分子遗传学对基因概念的发展 随着现代遗传学的发展，在分子水平上，根据重组、突变和功能将基因分成3个单位： 1）突变子：就是指性状突变时产生突变的最小单位。一个突变子可以小到只有一个碱基对； 2）重组子：就是指性状重组时，可交换的最小单位。一个交换子可以只包含一个碱基对； 3）顺反子：表示一个起作用的单位，基本符合通常所述的基因的大小或略小。一段DNA与一个多肽链合成相对应，平均为500-1500个碱基对。 三、现代分子遗传学中基因的概念 (一)、现代基因概念 顺反子学说进一步把基因具体