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WesternBlot 问题解答 凝胶肿胀或卷曲：注意转膜之前，切割下来的凝胶一定要在转膜缓冲液中浸泡平衡 5-10 分钟，要含有 20%的甲醇。 条带歪斜、或漂移 因为转膜仪使用时间太长，两块板之间的海绵由于长期使用变得很薄。当按照阴极 -海棉- 滤纸-胶-膜-滤纸-海绵依次放好后两块板不能压紧，因而在胶和膜之间可能存在潜在的间 隙，电转移时蛋白从胶和膜之间的空隙中流走，形成如图所示的形状。使用十几张普通的草纸垫在两块海棉之间，条带就可以变得非常的漂亮。 另外，转膜时转膜液一定要浸没凝胶和膜，否则也可能出现上述情况。 单个或多个白点：转膜时在膜与胶之间有气泡。做三明治时一定要逐层压紧，赶尽气泡。同时转膜液要提前配置好，加好甲醇，保证转膜前夜体内气泡排净。气泡存在的局部会抵抗 蛋白转膜，降低转膜效率。 4、转膜缓冲液过热： 缓冲液离子强度太低，或电压及电流过高。按照上述方式配液，同时转膜过程中注意降温。我在冰水混合物中转膜，效果很好。 5 背景过高！ 封闭不全，我用5%-10%的光明脱脂奶粉，效果还可以，现在做基本上没什么背景。如果你觉得不够可以加点BSA,1%吧。 一抗或者是封闭液与膜蛋白的交叉反应。这种情况通常可以通过加入 TWEEN-20 或多次洗膜加以解决。如果问题不能解决，那么降低一抗浓度，或更换封闭液种类可能解决 3）一抗二抗中某些不纯的物质也可以造成背景。 4）抗体浓度太高，或孵育时间太常都可能遇到这种情况。那么可以适当降低一抗二抗的浓度，或是用提高温度的方式来代替杂交时间的延长；另外，少量多次得洗膜效果要优于多量而长时间得洗膜效果。 5)曝光时间的控制。通常我们线曝光一分钟试试，条带清晰背景也强，可以缩短曝光时间， 或者过一段时间等荧光减弱以后再发光，一般也可以发出比较好的条带。如果背景强于条带， 那么肯定是前面默默个原因的一种，这是可以将膜在TBST 中漂洗以下再发光，有时会有比较好的效果（仅限于国外较好的试剂盒，国产的不行，洗一下啥也没了！）这个时候可以洗膜，洗膜后重新发光。 6、没有信号： 用单抗时比较容易出现这种情况。因为单抗主要是针对天然蛋白，这个时候.TWEEN-20 的作用就显现出来了，它可以增加抗原抗体复合物与膜的结合。 确信你的蛋白表达 确信蛋白高效的转移到你的膜上 一抗二抗的效价问题。无论哪个无效都不能发光，因此预实验一定要从最低的稀释度开始， 以排除抗体的因素 ECL 试剂盒质量的问题，不可小觑。偶亲身经历。碰到一批次品。两个月白搭！ 7、微量进样器堵了怎么办？ 首先从预防入手，每次用后的进样器及时用蒸馏水清洗！ 如果堵了，不要紧，有办法：可以用如下办法解决： 1）首先反复推拉上样针，看是否可将堵塞物吹出来； 2）方法 1 不灵，若是 25 或 50ul 的针，把针从后侧拔出，然后重新插入，使其内部产生气压，可能压出堵塞物质； 3）如上述方法不灵可以在拔出后注入些清水，然后重新插入，用水压排出， 4）最后的方法，最灵的方法：开始步骤同第3 种方法中，在加入水后，将上样器的前端针部放在酒精灯上煅烧至红色（估计在什么位置堵的），注意 烧红部分不要距离玻璃过近，然后，趁热突然推 针，将水强行推出，通道打开后，再通过稀酸或稀碱冲洗即可！ 5）或者放在超声清洗仪里，超声试试 注意，切记在推拉过程中小心不要把针弄弯8、关于 SDS 蛋白电泳的一点心得 最近在做蛋白电泳时候遇到了些麻烦，在这里发了帖子，并且得到了很多同人的恢复。本人 在看过回帖后，结合自己的试验，重新设计了方案，得到了满意的结果，同时感觉有必要拿来和大家分享： 1）蛋白电泳中出现的纵向条带：原因主要是由于电泳样品或是电极缓冲液中有没有溶解的 样品颗粒所致，上样前充分将样品离心，或重新使用新配电极缓冲液即可解决。 2）电泳条带前沿在染色脱色后呈尖形。原因是由于上样量大且工作电压过大引起，我实验 中采用 90/120，后来改用了80 并且不换电压；同时减少上样量到原来的一半，得到了满意的结果（我的样品分子量 18000 Da，15%的分离胶）； 3）电泳结束后，染色脱色结果整个胶面呈现蓝色，背景很重 怎么也脱不去，改用新配的电极缓冲液。问题解决。是电极缓冲液污染的结果（平时本人有个坏毛病：喜欢在缓冲液中涮上样针，导致缓冲液污染 ）。 分别用多大电流转膜? 一般跟你的分离胶的浓度有关。 与你的转印系统型号有关！ 与目的蛋白的分子量有关 1 一般 50KD 左右的蛋白，50