综合性实验一 质粒DNA的小量制备和电泳鉴定.ppt

综合性实验二 质粒DNA小量制备和电泳鉴定 一．实验目的 1．掌握碱变性裂解法制备质粒DNA的原理。 2．了解质粒DNA的性质和用途。 3. 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。 4. 掌握质粒DNA（闭环和开环构型）的电泳分离鉴定。 质粒 plasmid 质粒是细菌染色体外的环形双链DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。 质粒 基因工程中目的基因的运载工具。 质粒载体 大小可从1kb到200kb 筛选标记 多克隆位点 酶切位点 复制原点 质粒的特性： 能独立自主进行复制。 细菌内的共生型遗传因子，能垂直遗传。 能赋予宿主细胞一些表型。 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。 质粒的应用 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的分子，以超螺旋形式存在。 Visualization of topoisomers. In this experiment, all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling. Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrophoresis. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是D-半乳糖和3.6-脱水-L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。 因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常用于LDH、CK等同工酶的检测。 ■ 影响电泳迁移率的因素： Friction Charge 外加电流、电压 分子量 分子形状 分子的等电点 Voltage CATHODE ANODE + - - + 琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术 在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比； 分子构型也对迁移率有影响，如共价闭环DNA＞直线DNA＞开环双链DNA。 当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为0，而同等大小的直线DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于0。 差速离心DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION 离心:利用离心机转子高速旋转产生的强大的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质分离开 。 二．实验原理 质粒提取原理 质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤： 1. 培养细菌使质粒扩增 2. 收集裂解细菌 3. 分离纯化质粒DNA 去除蛋白质 去除RNA 去除基因组DNA 苯酚-氯仿抽提法 Rnase消化法 ？？？ 质粒DNA和基因组DNA的区别 大小不同 变性与复性有差异 质粒DNA较小，通常只有基因组DNA分子量的百分之一。 基因组DNA容易断裂线性化。 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目前常用的有： ? 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点选择。 ? 碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。 分离质粒DNA和基因组DNA的方法 碱变性法 煮沸法 羟基磷灰石层析法等 碱裂解法提取质粒的原理 应用最为广泛的制备质粒DNA的方法。 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 原理： 1. 强碱NaOH和SDS裂解细菌，细菌中的质粒DNA和基因组DNA在强碱条件下发生变性。 2. 怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性，而染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。 3. 怎样去除蛋白质？ 留有质粒DNA的上清，经酚/氯仿去除蛋白质后，用乙醇沉淀DNA，即得到质粒DNA。 三、试剂与仪器 Biospin质粒DNA小量提取试剂盒： Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutralization buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase solution, Spin c