动物免疫学实验技术-免疫印迹技术.doc

PAGE · PAGE 1 · 第十七章 免疫印记技术 (Western-blotting technique) 概 述 （一）原理 Western-blotting印记是将蛋白质经分离后从凝胶转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。 材料和方法 (一) 材料 1． 质粒 pW425t+SO7 2. 宿主菌菌株 E.coli X51，-86℃保存 3. 培养基 LB基本培养基平板 4. SDS试剂 (1) 30%丙烯酰胺／甲叉双丙烯酰胺：29.2g丙烯酰胺，0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于终体积为100ml的去离子水中，4℃保存。 (2) 1.5Mol/L Tris-HCl pH 8.8：18.15g Tris碱，溶于去离子水中，浓盐酸调pH至8.8，定容至100ml。 (3) 0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8：6g Tris碱，溶于去离子水中，浓盐酸调pH至6.8，定容至100ml。 (4) 5×电泳缓冲液(pH8.3)：Tris碱45g，甘氨酸216g，SDS 15g，溶于终体积为3 000ml的去离子水中，4℃保存。使用时5倍稀释。 (5) 2×上样缓冲液：SDS 500mg，β-巯基乙醇1ml，甘油3ml，溴酚蓝4mg，0.5Mol/L Tris-HCl pH 6.8缓冲液2ml，加去离子水至10ml。 (6) 染色液：甲醇500ml，冰乙酸100ml，考马斯亮蓝2.5g，加水至1000ml。 (7) 脱色液：甲醇250ml，冰乙酸70ml，加水至1000ml。 5．Western印迹试剂 (1) 转移缓冲液：甘氨酸2.9g，Tris碱5.8g，SDS 0.37g，甲醇200ml，加水至总量为1 000ml。 (2) 封闭液：含3%BSA的PBS。 (3) 洗涤液：PBST(0.05%Tween-20)。 (4) Tris平衡盐溶液：溶解8.77g NaCl于800ml 10mMol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中，用缓冲液补足至1 000ml。 (5) 4-氯-1-萘酚底物溶液：溶解30mg 4-氯-1-萘酚于10ml甲醇中，取2ml加至10ml Tris平衡盐溶液中，加5μl 30% H2O2混合均匀，5-10min内使用。 (7) 氨基黑染色液：0.1%氨基黑，25%已丙醇，10%醋酸。 6.其它试剂及配制 (1) 10mMol/L萘啶酮酸钠：取250mg萘啶酮酸钠，溶解于终体积为10ml的去离子水中，滤过除菌，小量分装，-20℃保存。 1Mol/L IPTG：取1g IPTG溶于3ml去离子水中，加水至4.2ml。滤过除菌，小量分装，-20℃保存。 （二） 方法 1.对数生长期E.coli X51的制备 (1)冻干菌株的复苏及保存:同E.coli TG1。 (2)对数生长期细菌制备:即挑取基本培养基平板上单个菌落至5ml LB培养基中，37℃、250rpm振摇培养过夜。取100μl过夜培养物接种10ml LB培养基，37℃、250rpm振摇培养至A600为0.3。 2.重组质粒的制备 挑取-80℃冻存的鉴定为阳性克隆。 3. SO7基因的可溶性表达 挑取LB上单个菌落至5ml新鲜制备的LB中，30℃、250rpm振摇培养过夜。 4.表达产物的检测 (1)SDS检测：① 12%分离胶配制：双蒸水3.35ml，1.5MOL/L Tris-HCl (pH8.8)2.5ml，10%SDS 0.1ml，30%丙烯酰胺4.0ml，10%过硫酸胺50μl，TEMED 5μl；②4%浓缩胶配制：双蒸水1.22ml，0.5MOL/L Tris-HCl (pH6.8)0.5ml，10%SDS 20μl，30%丙烯酰胺0.26ml，10%过硫酸胺10μl，TEMED 2μl；③待胶凝固后，取下梳子；④样品加等量上样缓冲液混匀，100℃煮沸2min，12000rpm离心5min，上样后稳压条件下电泳，浓缩胶100V、分离胶150V，至溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳；⑤取出凝胶染色2-3小时后脱色，观察蛋白带。 （2）Western-blotting检测：①SDS结束后，取出凝胶，将在转移缓冲液中浸泡约30min与凝胶同样大小的Hybond膜和3mm滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-Hybond膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中，各层间不能有气泡。转印时凝胶侧接负极，Hybond膜侧接正极，转印电泳槽置冰浴中，200mA恒流转印1小时；②转印结束后，按加样孔的位置，剪下分子量标准的膜条用氨基黑染色，观察转印效果。其余部分置于封闭液中室温振摇1小时；③取出后置于用封闭液稀释为1：1000的HRP／兔抗鸡IgG-HRP结合物中，室温振摇1小时；④取出膜用洗涤液洗