人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备.docVIP

人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备 文档信息 属性： Doc-03VRJ5，doc格式，正文11081字。质优实惠，欢迎下载！ 说明： 作为医药学资料、临床医学资料的写作参考资料，提供解决怎么写及格式等相关问题。 适用： 作为文章写作的参考文献，解决如何写好实用应用文、正确编写文案格式、内容摘取等相关工作。 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备 2 1 材料和方法 2 2 结果 4 3 讨论 7 文2：人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备 8 1 材料和方法 9 2 结果 11 3 讨论 13 参考文摘引言： 14 原创性声明（模板） 16 文章致谢（模板） 16 正文 人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备 文1：人CD1d分子胞外区的原核表达及其多克隆抗体的制备 CD1分子是独立于MHC分子之外的第三类抗原提呈分子， 分为CD1-I和CD1-II两组， 前者包括CD1a、 CD1b、 CD1c和CD1e等4个分子， 后者只有CD1d分子［1］。CD1d分子由胞内区、 跨膜区和胞外区组成， 胞外区又由α1、 α2和α3等3个结构域组成， 它主要提呈糖脂抗原， 在免疫调节及与感染性疾病、 自身免疫性疾病、 肿瘤等疾病的发生发展过程中起重要作用［1， 2］。在CD1d基因克隆过程中， 我们发现在某些疾病患者体内存在α3结构域或跨膜区缺失的变异体， 跨膜区缺失的变异体的存在提示患者体内可能存在可溶性CD1d分子。为此， 我们拟建立双抗体夹心ELISA法进行可溶性CD1d分子的检测， 但目前尚未见有其商品化ELISA检测试剂盒。特异性抗体的获取是建立ELISA检测方法的关键所在， 在成功制备兔抗人CD1d分子 α3结构域抗体［3］的基础上， 我们又对人CD1d分子胞外区编码基因进行了重组表达， 并制备了其鼠源性抗体。 1 材料和方法 材料 大肠杆菌DH5α、 大肠杆菌DL21-DE3为本室保存。克隆载体pGEM-T、 反转录试剂盒购自Promega公司; 表达载体pET28和Ni2+-NTA凝胶为Invitrogen公司产品。RNA提取试剂、 PCR产物回收、 质粒纯化试剂盒为QiaGen公司产品。Taq酶购自大连宝生物工程公司。IPTG及DAB购自上海生物工程有限公司。HRP标记的羊抗鼠IgG为Chemicon公司产品。PVDF膜为美国PALL公司产品， 常规试剂为国产分析纯。引物合成及DNA序列测定委托上海生物工程公司完成。BALB/c小鼠由广东医学院实验动物中心提供。 方法 CD1d分子胞外区编码基因的克隆 取手术切除的新鲜人小肠组织抽提RNA， 经鉴定RNA无降解后进行反转录， 操作按反转录试剂盒说明进行。以合成的cDNA为模板进行hCD1d 胞外区编码基因扩增， 引物如下: 1: 5′-CCATGGTCCCGCAAAGGCTTTTCCC-3′(划线部分为Nco I酶切位点)， 引物2: 5′-CTCGAGCCAGTAGAGGACGATGTCCTG-3′(划线部分为Xho I酶切位点)。PCR 条件为94℃变性30 s， 55℃退火50 s， 72℃延伸40 s， 32个循环后， 于72℃延伸7 min。PCR 产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳分析回收纯化。将纯化的PCR产物与pGEM-T载体连接后， 转化感受态大肠杆菌DH5α。转化菌液涂布于含氨苄青霉素、 X-gal和IPTG的LB平板， 于37℃培养过夜， 挑取白色菌落进行培养， 提取重组质粒， 以EcoR I进行酶切鉴定， 将质粒命名为pGEM-T/hCD1d。阳性克隆进行DNA 测序， 对所得序列用BLAST 软件进行序列同源性分析。 原核表达载体的构建 用Nco I和Xho I分别对pGEM-T/hCD1d质粒和原核表达载体pET28进行双酶切， 凝胶电泳后， 纯化回收切下的hCD1d基因片段和pET28片段， 并用连接酶将2个片段16℃连接过夜， 连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞， 然后将菌液涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB平板， 筛选阳性表达克隆， 进一步用 PCR和测序进行鉴定， 命名为pET28/hCD1d。 目的蛋白的诱导表达 重组质粒pET28/hCD1d转化感受态菌大肠杆菌BL21(DE3)， 37℃培养过夜。挑取菌落经PCR筛选及测序鉴定正确后， 接种于 LB液体培养基（含50 mg/L卡那霉素）， 37℃培养过夜后， 按1∶100比例接种到LB液体培养基中， 待菌液的A600值达 ~时加入IPTG(终浓度为1 mmo