PCR基因扩增仪学案.ppt

PCR基因扩增仪  (PCR Gene Amplifier) 环境科学与工程 余晓玲 内容提要 1. PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 2. PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪 3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程 PCR扩增仪的性能指标 PCR扩增仪的操作规程 4. PCR扩增仪的应用 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 一、PCR技术的发展 Khorana (1971)等最早提出核酸体外扩增的设想：“经DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可合成tRNA基因。” 202X年，Kary Mullis在Cetus公司工作期间，发明了PCR。Mullis要合成DNA引物来进行测序工作，却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。 202X年4月的一个星期五晚上，他开车去乡下别墅的路上,猛然闪现出“多聚酶链式反应”的想法。 202X年10月25日申请了PCR的专利，202X年7月28日批准（专利号4,683,202 ），Mullis是第一发明人； 202X年12月20日在Science杂志上发表了第一篇PCR的学术论文，Mullis是共同作者； 202X年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法。 聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 二、PCR技术的原理 体外核酸扩增，加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs(脱氧核糖核苷三磷酸)，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待测样本中的核酸拷贝数。 简单的说，PCR仪就是利用DNA聚合酶对特定基因做体外或试管内的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶进行专一性的连锁复制。目前常用的技术，可以将一段基因复制为原来的一百亿至一千亿倍。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备 模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； DNA模板与引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 PCR基因扩增仪的工作关键 DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。 从PCR反应基本原理可以看出，PCR基因扩增仪工作关键是温度控制。 第一节 PCR基因扩增仪的工作原理 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 荧光实时定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术 在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针 荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加 通过检测荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 实时荧光定量PCR仪 金属板式实时定量PCR仪 离心式实时定量PCR仪 各孔独立控温的定量PCR仪 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 金属板式实时定量PCR仪 可作为普通PCR仪使用 可带梯度功能 可容纳的样本量大，无需特殊耗材 温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致 第二节 PCR扩增仪的分类与结构 ABI 7500荧光定量PCR仪 MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪 Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪 第二节 P