流动相梯度的选择.pdfVIP

.流动相的选择 常用做反相流动相的溶剂是甲醇和乙腈，甲醇有其性价比的优势，但 是甲醇活性高，可能与某些样品发生反应，而且甲醇在低波长下有紫 外吸收，会降低分析方法的灵敏度；乙腈虽然价格很高，毒性比甲醇 大，但是洗脱能力比甲醇强，很少与样品发生反应，用作流动相系统 压力要比甲醇低很多，且截止波长比甲醇低20nm，增加了检测出在 低波长下才有吸收的杂质的可能性，所以我们一般倾向于多用乙腈， 少用甲醇。但是有时候样品峰形不好或者分离不好，更换溶剂试试是 一个很好的选择，毕竟不同的溶剂提供不同的选择性。 对流动相的优化主要在水相上下功夫，水里可以加酸、加碱、加盐， 从而改善峰形、提高分离度。流动相里加碱的情况比较少，主要还是 加酸，常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸 等，其中最常用的是磷酸和三氟乙酸，磷酸在低波长下没有紫外吸收， 而三氟乙酸在低波长下有，但是三氟乙酸易挥发而磷酸不行，所以单 纯做液相，低波长下磷酸最合适，三氟乙酸有吸收，运行梯度时基线 漂移很严重，而做液质就要考虑首选三氟乙酸了，近些年还比较流行 加甲酸或乙酸。一般情况下这几种酸没有太大区别，我们更多的是考 虑通过加酸改变流动相的pH值，从而改善样品的分离度和峰形。下 面两图是流动相的pH值改变对一组样品分离和峰形的影响。 从图中可以看出： 1)流动相pH值改变可以改变样品的保留时间和分离度； 2)流动相pH值改变甚至可以改变某些样品出峰的先后顺序； 3)流动相pH值改变可以改变样品的峰高，即可以调整峰形。 相同进样量样品峰越高则意味着峰形越好，从图中可以看出多数样品 在低pH值下峰形都比中性要好，这个主要是由色谱柱本身的性质所 决定的。色谱柱主要都是硅胶基质，现有的填料处理工艺无法将硅胶 上残余的硅羟基全部去除，硅羟基会造成样品峰拖尾，一般认为硅羟 基的pKa在3.5到4.5之间，低pH值能帮助抑制硅羟基的活性，减 小拖尾，从而改善峰形，提高分离度。水溶液中添加0.1% （体积） 的磷酸或者三氟乙酸其pH值大概在2左右，用作流动相正好抑制硅 羟基的活性，所以开发液相分析方法时流动相首选水加0.1%的磷酸， 然后再以此为基础做优化。 在单独用酸不行的时候就要考虑使用缓冲盐，缓冲盐的选择原则是： 简单、稳定、缓冲能力强、配制简单，需要调pH值时要有相应的酸 或碱。常用的缓冲盐是磷酸盐，主要是钾盐和钠盐，再有就是醋酸盐， 常用的盐浓度在10~20mM左右。以前因为色谱柱填料生产工艺的问 题，往往需要在流动相里添加三乙胺来减少拖尾，但是三乙胺对色谱 柱的寿命有很大影响，现在新的色谱柱都不再需要了。流动相里有时 会需要调节pH值到碱性，具体pH要视色谱柱的耐受范围而定，常 用 NaOH、KOH溶液或氨水做为调节缓冲盐溶液碱性pH 的试剂， 也可以往水里单独添加氨水做碱性流动相。 在缓冲盐做流动相时，出峰太早、峰形很差、相似结构的化合物峰因 为拖尾或峰型太宽而不能达到基线分离时，可以考虑使用离子对试 剂，常用的离子对试剂主要是各种烷基磺酸钠和四丁基铵盐，但是流 动相里使用离子对试剂时，系统需要的平衡时间长，样品保留时间不 是很稳定，因为离子对试剂的背景吸收基线会很差，且做完样品后需 要长时间清洗，所以我们尽量不使用离子对试剂。 使用缓冲盐时要注意流动相混合以后盐可能析出的问题和盐背景吸 收导致基线漂移严重的问题，尤其是在流动相里添加醋酸铵以后，在 低波长下梯度变化时基线下降非常严重，严重影响对含量较小杂质的 准确定量，可以考虑在乙腈里加入10%的水，水中预先加入10倍水 溶液浓度的缓冲盐，这样梯度中A、B两项盐的浓度相同，可以避免 基线漂移严重的问题。 原料药一般结构式比较大，分子构成比较复杂，开发分析方法时用水 加磷酸效果可能效果不好，通常还要求最少尝试2和6.5两个pH值 的磷酸盐缓冲溶液，并依据结果对流动相进行pH优化，如效果不理 想再进一步尝试其它缓冲盐溶液。开发中间体或者 IPC 的分析方法 时可以根据经验酌情简化流动相的选择过程。 3.梯度的优 梯度优化主要是通过调节流动相的起始比例和梯度的斜率来调整样 品的保留时间，优化样品的分离度。下图是梯度中有机相起始比例的 变化对一组样品分离的影响。 从图中可以看出：有机相起始比例越小，样品保留时间越长，随着梯 度的改变，样品出峰的先后顺序也有可能改变。我们做梯度优化时主 要调整梯度的起始比例和斜率。现在的色谱柱或者采用了新的封端工 艺，或者内嵌极性基团，耐水的能力都比较高。在酸性条件下很多化 合物都以离子形式存在，极性较大，为了提高样品的分离度，尽量使 用大比例的水做梯度