Locked Nucleic Acid (LNA) —— 锁核酸介绍演示.pdf

Locked Nucleic Acid (LNA) —— 锁核酸 ⚫ 提高热稳定性和杂交特异性 ⚫ 改进qPCR 检测的信噪比 ⚫ 增强对单个核苷酸的识别 背景 锁核酸（LNA）是一种含有桥接双环糖基（bridged, bicyclic sugar moiety）的合成核酸类似物。 在2'-O-和4'-位之间添加的亚甲基基团将呋喃核糖环“锁定”为3'- 内构象（3’-endo conformation， 见图2 ）。这种构象形成了A 型RNA 的特征结构。由于这种双环糖骨架的限制，LNA 只会形成A 型 双链体。此外，LNA 完全遵守Watson-Crick 的碱基配对原则。因此LNA：DNA 杂交双链体可以由 序列互补的DNA 和LNA 自发形成，并且研究发现，LNA：DNA 杂交体与其对应的DNA：DNA 相 比，其退火温度会大幅度升高[1]。由于LNA 的合成与标准寡核苷酸合成相容，因此可以直接将单个 或多个LNA 核苷酸位点选择性地掺入DNA 序列中。这些含有LNA 的寡核苷酸与它们的互补的DNA 序列退火后形成嵌合LNA：DNA 杂交体。这些杂交体也均为A 型构象，并且与相应的DNA：DNA 双链相比，Tm 值也会显著升高。粗略估算，每个掺入短 DNA 引物（<30 nt）的LNA 核苷酸可使 Tm 值增加3-8℃ [2]。总而言之，LNA 的主要优点在于其可对所需寡核苷酸的Tm 值进行微调，从 而成为引物和探针设计时的选择。由于结合亲和力更强，所以可以合成更短的探针，同时其对目的 DNA 的结合特异性也更强。因此，推荐将LNA 用于需要高特异性和/或可重复性的任何杂交检测， 例如 PCR 引物、双标记探针、原位杂交探针和分子信标。此外，由于相同的原因，LNA 修饰的寡 核苷酸也可以成为反义药物开发的一种有趣的候选物[3]。 Figure 1: Structural drawings of DNA, RNA and LNA nucleotides Figure 2: LNA 3’-endo conformation 1 提高qPCR 探针的热稳定性 LNA 优异的杂交特性使其可在qPCR 探针的设计中被用来微调Tm 值[4]。这一特点显著拓宽了 检测条件的范围，令qPCR 实验更成功。当探针由LNA 核苷酸组成时，能够改善其对靶序列杂交的 亲和力和特异性。这反过来减少了虚假结合的背景荧光，并且有更好的信噪比。 多重qPCR 系统 由于可以使用LNA 调整qPCR 探针的Tm 值，因此可以获得具有不同GC 含量的几个短序列的 标准化Tm 值。例如，富含AT 的天然状态DNA qPCR 探针通常需要超过30 个碱基长（有时需要 超过40 个）以满足扩增子设计指南，但仍有可能表现不佳。使用LNA qPCR 探针，通过选择性定 位LNA 核苷酸，有助于产生最佳的、具有高度特异性的短探针。较窄的Tm 值范围对于微阵列和多 重PCR 应用特别有益，特别是当探针必须在相同条件下与许多不同靶标的同时结合时。 增强对单核苷酸的识别 掺入LNA 核苷酸后，由于LNA 在错配形成Watson-Crick 碱基对时具有强烈倾向，因此qPCR 探针通过单核苷酸多态性（SNP）区分等位基因的能力会大大增强[5]。热变性研究表明，当LNA 掺 入在寡核苷酸的特定位置时，完美匹配和错配之间的Tm 值存在显著差异（见图3）。因此，在SNP 测定中，与天然状态 DNA 探针相比，LNA qPCR 探针杂交具有更强的不稳定性因此能够更好地区 分出错配。 Figure 3: Influence of LNA on the melting temperature (Tm) and the resulting larger difference between specific (1p) and non-specific (1m) signals 反义技术（Antisense Technology ） 由于对互补核酸的结合亲和力增强，LNA 很有可能被用于反义技术，与此同时LNA 的高核酸酶 抗性是体内和体外应用的重要优势。大量研究证实了LNA 作为反义试剂的优越性，常规技术即可用 于转染LNA 寡核苷酸。对于knockdown microRNA 或其他小RNA 等实验目的，可