1-大肠杆菌重组蛋白表达提取及纯化实验.docxVIP

第一天 1、配置 LB 培养基： 酵母粉 15g、胰蛋白胨 30g、氯化钠 30g，定容至 3000ml。调节 PH 至 7.4（2M NaOH），高压蒸汽灭菌 20 分钟，37℃保存。分装成 15 瓶（每瓶 200ml）。 2、接种（超净台要提前杀菌通风） 取 4 瓶上述培养基，每瓶加 200μlAMP（1:1000）、60μl 菌液。37℃过夜。 第二天 1、扩大培养（超净台） 4 瓶扩至 16 瓶，每瓶培养基加 200μlAMP，摇床培养 1 小时左右。 2、诱导（超净台） 加 40μlIPTG，加完后去除封口的除牛皮纸，扎口较松。25℃摇床培养 4 小时。3、离心获取菌体 4℃，8000rpm 离心 25 分钟。注意配平。 4、超声波破碎菌体 离心后去上清，向沉淀加入（600mlPB 裂解液、300μl 溶菌酶、3mlPMSF）。将菌液转入 2 个烧杯中，冰浴超声波破菌，400W，75 次，每次6 秒，间隔2 秒。离心收集上清液。 600mlPB 裂解液：20mM/L PB，10mM/L EDTA，5%甘油，1mM/L DTT，调节 PH 至 7.4。 超声波破碎：首先用去离子水清洗探头，再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中，冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中，不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤（双层滤纸) 洗胶（GST）。将上述上清液抽滤，滤液与 GST 胶混合，磁力搅拌过夜。 第三天 1、抽滤蛋白-胶混合液，滤液取样 20μl，留电泳。 2、洗杂蛋白，用 1×PBS+PMSF(1000:1)约 400ml，洗脱若干次，用移液枪吸去 上层泡沫（杂蛋白），至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白，洗脱液加 50ml，分 3 次进行（15+15+15），每次加入后间歇搅拌，自然静置洗脱 15 分钟，抽滤，勿使胶干，合并洗脱液，取样 20μl，留电泳。用洗脱液调零，测 OD280。（OD 值达到 1.5 为佳） 4、将洗脱液置于透析袋中（透析袋应提前煮好），将透析袋置于 2L 透析液 1 中， 加入磁珠置于 4℃冰箱内磁力搅拌器上，4 小时后换为透析液 2。胶的回收：用3M 氯化钠溶液（用 1×PBS 溶液溶解）、1×PBS（无沉淀）洗涤，20%乙醇洗脱， 装瓶。 洗脱液：50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH 透析液 1：20mM/L TRIS-HCL、 1mM/L EDTA 、 0.15mM/L DTT 透析液 2：:0.5mM/L EDTA、1×PBS