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淀粉酶活力的测定方法 淀粉酶主要包括a 淀粉酶、禺淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和 R-酶，它们广泛存在于动 物、植物和微生物界。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。植物中最重要的淀粉酶是 a -淀粉酶和伕淀粉酶。 a-淀粉酶随机作用于直链淀粉和支链淀粉的直链部分 a-1,4 糖苷键，单独使用时最 终生 成寡聚葡萄糖、 a 极限糊精和少量葡萄糖。 Ca 2+ 能使a 淀粉酶活化和稳定，它比 较耐热但不 耐酸， pH 3.6 以下可使其钝化。 俟淀粉酶从非还原端作用于a-1,4 糖苷键，遇到支链淀粉的 a-1,6 键时停止。单独 作用 时产物为麦芽糖和 俟极限糊精。伕淀粉酶是一种巯基酶，不需要 Ca 2+及 CI 等辅助因子， 最适 pH 偏酸，与a-淀粉酶相反，它不耐热但觉耐酸， 60 C 保温 15min 可使其钝化。 通常提取液中 a-淀粉酶和 伕淀粉酶同时存在。可以先测定( a+ ?淀粉酶总活 力,然后 在 60 C 加热 15 min，钝化淀粉酶，测出a-淀粉酶活力，用总活力减去 a -淀粉酶活力，就可 求出 伕淀粉酶活力。 淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的还原糖与 3,5-二硝基水杨酸的显色反应 来测定。还原糖作用于黄色的 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色的 3-氨基-5-硝基水杨 酸，生成 物颜色的深浅与还原糖的量成正比。以每克样品在一定时间内生成的还原糖(麦 芽糖)量表 示酶活大小。 1 酶活测定方法 (1)标准曲线的制作 (见下表) ①取 7 支 20 ml 具塞刻度试管，预先洁净灭菌干燥，编号，按表加入试剂。②摇匀，至 沸 水浴中煮沸 5 min。取出后流水冷却 ，加蒸馏水定容至 20 ml,以 1 号管作为空白调零点， 在 520 nm 的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。 表 1 标准麦芽糖溶液成分表及 0D 测定值 试剂 试剂 1 2 3 4 5 6 7 麦芽糖标准液(mL ) 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 H2O (mL) 2.0 1.8 1.4 1.0 0.6 0.2 0 3,5-二硝基水杨酸(mL ) 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 麦芽糖含量(mg) 0 0.2 0.6 1.0 1.4 1.8 2.0 OD520 (2)粗酶液淀粉酶活力测定 ①待测粗酶液的制备： 发酵 24 h 后发酵液 4000 r/ min 离心 10 min,去除菌体，在上清液中加入 65%饱和度 的 硫酸铵，待硫酸铵充分溶解后于 4C 盐析 2h，然后 5000r/min 离心 20min，得到初步 纯化的淀粉酶。 ②按以下顺序操作： 取预先洁净灭菌干燥试管，编号。取粗酶液 1 ml 于各只试管中，于 60C 水浴中预热 5min 柠檬酸淀粉缓冲液同时在 60C 水中预热 5min,-取柠檬酸淀粉缓冲液 1ml 加入试 管中, 于 60C 水浴中保温 30min-加入 1.5 ml 3,5-二硝基水杨酸，沸水中 5 min,加入氢氧化 钠溶液 终止反应，加蒸馏水至 20 ml 。-摇匀，用分光光度计测定 OD520 nm 值。在上述条 件下以 单位体积样品在 30 min 释放 1 mg 麦芽糖所需的酶量为一个麦芽糖单位表示酶活 性。 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量按下列公式计算酶活力 酶活力测定公式: 淀粉酶活力=麦芽糖含量(mg) ?淀粉酶原液总体积(mL) /所加淀粉质量 每个样 品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入 试剂的时间间隔 要绝对一致： 依次加入 DNS 试剂 (ml) 反应顺序 样品稀释液(ml) 蒸馏水 依次加入淀粉溶液 (ml) 1.5 样品(重复 3 个) 1 0 60E 预热 5min 1.5 1.5 样品空白 1 0 1.5 1.5 标准空白 0 1 1.5 混合 60E 保温 30min 混合 100C 煮沸 5min 加入 0.4mol/L NaOH 溶液终止反应 加入蒸馏水至总体积 20 (ml) 20 20 反应后的试样在室温下静置 10min，如出现混浊需在离心机上以 4,000rpm 离心 10min, 上清液以标准空白调零，在分光光度计 520nm 波长处测定样品空白(A。 )和样 品溶液 (A)的吸光值， A- A0 为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。 2 活性计算 酶活力单位定义：在 60C、PH5.6 条件下，每小时从 2%的可溶性淀粉溶液中释放出 1mg 尔