应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和试剂发明专利.pdf

应用肿瘤特异性启动子表达报告基因来检测循环血中肿瘤细胞的方法和 试剂 大多数癌症患者死于肿瘤转移，转移是指肿瘤细胞通过循环系统从 原 发部位扩散到远离部位，并在新的器官中繁殖生长成新的转移瘤 (Eccles and Welch，2007)。据估计，每克肿瘤组织每天约有106细胞 (Chang et al. 2000 Butler and Gullino 1975) 进入血液 ， ； ， ，不过这其 中的大部分很快会清除(Butlerand Gullino，1975；Luzzi et al.，1998)。 但是，众所周知，肿瘤细胞的侵入和转移在早期就会发生，甚至在癌症 确诊前的很多年就会发生。因此，检测血液中的循环肿瘤细胞是癌症早 (Husemannet al. 2008 Gray 2003 Kohnand Liotta 期诊断的有效方法 ， ； ， ； ， 1995)。另外，最近一项研究表明手术前的循环肿瘤细胞(CTC)水平与癌 症患者的总存活期存在相关性，而且术前术后循环肿瘤细胞数量的比较 (Scheret al. 2009 de Bono et al. 2008) 可能是治疗反应的指示剂 ， ； ， 。 因此，有效的检测循环血中肿瘤细胞不仅有益于癌症的早期诊断，而且 对预后和治疗反应很有帮助。 1) 目前检测循环血中肿瘤细胞的方法有三种： 检测上皮细胞特异性蛋 2) mRNA 白的免疫测定； 基于分子测定的检测肿瘤或上皮细胞特异性 的 PCR方法；3)检测与癌症有关的染色体畸变或基因扩增的荧光原位杂交。 免疫测定是通过使用固定在磁性颗粒上的抗体来捕获表达某些组织、 器官或肿瘤特异性抗原的细胞。由于大多数实体瘤来自上皮细胞源的细 胞，因此在上皮细胞中特异性表达的蛋白(如角蛋白cytokeratins(19，8， 18and 20) EpCam(Litvinov et al. 1994)) 和 ， 已经被用作区分上皮细胞病 和有核血细胞的生物标志物。但是，这个方法可能会导致一些假阳性或 假阴性结果。第一，因为入侵的肿瘤细胞因上皮细胞向间质细胞转变， 而 丢 失 原 有 的 上 皮 抗 原 ， 这 将 导 致 假 阴 性 结 果 (Willipinski-Stapelfeldt et al. 2005 Went et al. 2004) ， ； ， 。第二，非肿 瘤上皮细胞可能会存在于血液中，或者抗体可能会非特异性地与血细胞 0 -20 结合，这将导致假阳性结果。据估计，在正常对照中，约 ％ ％的角 cytokeratin (Goeminne etal. 2000) 蛋白 阳性细胞是白细胞 ， 。同时用血 细胞特异性的抗体(如CD45)对染可能会减少假阳性。抗器官特异性标 志物的抗体，如前列腺特异抗原(PSA) ，癌胚抗原 (CEA) ， mucin-1(MUC-1) (EGFR) (AFP) HER-2 ，表皮生长因子受体 ，癌胚蛋白 ，