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兔自身免疫性干眼模型制作及检测 兔自身免疫性干眼模型实验动物 :成年雌性新西兰白兔,体质量2、6～3、5kg。实验前进行兔子临床眼科检查, 排除已患有眼部炎症和其他疾病的动物,建立正常兔眼的临床检查指标的基线水平。饲养环境符合医学实验动物环境的要求,动物饲养房温度为 25±2℃,相对湿度 50%～75%,12 小时光照昼夜循环,通风状况好。兔自身免疫性干眼模型实验所用的主要仪器、设备及材料 :生物超净工作台CO2恒温细胞培养箱移液枪-80℃超低温冰箱倒置相差显微镜台式离心机裂隙灯显微镜摄像系统离心管、枪头PCR仪实时定量PCR仪流式细胞仪流式管超纯水装置低温水箱裂隙灯显微镜恒温水浴锅眼科手术器械祸旋仪高压蒸汽消毒器电子天平鼓风式干燥箱磁力搅拌器PH测量计荧光显微镜SY-600恒温水箱Nylon细胞滤网兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制 :淋巴细胞培养基(CM)RPMI1640细胞培养基450ml胎牛血清(FBS)10%青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM2-mercaptoethano 0、5ml泪腺上皮细胞培养基(DMEM)DMEM(1X high glucose)450ml胎牛血清(FBS)10%青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制 :Hams液Hams F-12 1LHepes 10ml/L牛血清蛋白蛋白(BSA)100U/ml胰蛋白酶抑制剂50mg/L丁酸 0、22g/L青链霉素100U/mlL-谷氨酰胺2mM亚油酸1mg/ml 42ul各组分充分溶解于900ml Ham’s F-12后调节PH值至7、4,Ham’s F-12定容至1000ml,0、22μm 滤器过滤,4℃冰箱保存备用。兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制 :Hanks液Hanks Salts 1bottleHepes 2、38gEDTA 0、76g各组分充分溶解于900ml 超纯水后调节PH值至7、4,超纯水定容至 1000mL,0、22μm 滤器过滤,4℃冰箱避光保存。混合消化酶(CDH)胶原酶 collagenaseⅠ 450unit/ml透明质酸酶 hyyaluronidase 200unit/mlDNA酶Ⅰ 25unit/ml分别称取计算好的Ⅰ型胶原酶和透明质酸酶,将其充分溶解于一定体积的 Ham’s液中,加入溶解分装好的 DNA 酶充分混匀,0、22μm 滤器过滤,4℃冰箱备用。兔自身免疫性干眼模型主要试剂及溶液配制 :10% FicollFicoll 粉与 DPBS 按比例配制高压灭菌, 分装后-20C 避光保存。实时突光定量 PCR 试剂盒 SYBR Green (Roche 491385001)PE-Anti-Human Foxp3 (Biolegend)Anti-Rabbit CD4(Mouse anti-Rabbit Monoclonal AntibodyAbD )淋巴细胞分离液 无 RNA 酶水(DEPC 水) 兔自身免疫性干眼模型实验方法 :1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养(1)新西兰大白兔肌肉注射陆眠宁和氯胺酮(两者的比例为2:3,0、3-0、4ml/kg)进行麻醉,剪去兔左眼睫毛,将生理盐水和碘伏按1:1稀释,充分清洗术眼结膜囊,再用生理盐水清洗,以免碘伏刺激眼表,后用0、5%盐酸丁卡因滴眼液滴术眼,后用无菌手术器械将麻醉后的兔子在超净台中操作摘取兔左下泪腺, 将泪腺转移到提早配置好的装有双抗和Ham’s液的50ml离心管中。(2)在细胞间超净台进行以下操作,将泪腺和少量的Ham’s液放入培养皿中,先剔除泪腺组织周围的血管、脂肪组织和筋膜,无菌刀将腺体切碎至约1mm×1mm的组织块,用移液枪加入Hank’s液后吹打吹散组织块,转移到50ml离心管中倾斜静置15min,弃掉上清。(3)然后再加入Ham’s液吹打均匀倾斜静置15min,小心弃掉上清,以防组织块的丢失。(4)加入配置好的消化酶(胶原酶,透明质酸酶,DNA酶),磁力搅拌器提早设置好温度和转速,37℃恒温水浴消化10min。兔自身免疫性干眼模型实验方法 :1、兔泪腺上皮细胞分离、纯化、培养(5)取出后静置15min,弃掉上清,加入10ml Hank’s液反复吹打后静置15min,弃掉上清。(6)再加入配置好剩余的消化酶,37℃水浴消化30min,观察组织块的大小,可适当的增减10min。(7)然后用Ham’s液浸润40μm无菌细胞筛,将其置于50ml离心管上,将稀释后的混合液吹打均匀后过滤,1000rpm离心6min,弃