乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化.docVIP

乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 1 1材料和方法 2 文2：乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化医学论文 6 1材料和方法 6 参考文摘引言： 10 原创性声明（模板） 11 文章致谢（模板） 11 正文 乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 文1：乙型肝炎病毒截短C基因与前S1基因在大肠杆菌中的融合表达及纯化 0引言 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus， HBV)导致的病毒性肝炎目前尚无十分有效的治疗措施，疫苗接种是控制和预防乙型肝炎的重要手段，但部分人群对现有的疫苗不应答或低应答而导致接种失败，因此需要研发新型HBV疫苗. 我们利用基因重组技术构建含截短C基因和preS1基因联合的原核表达载体，在大肠杆菌中表达融合蛋白并进行纯化，初步分析其免疫性和特异性，为比较不同来源的HBV候选疫苗分子和深入研究HBV新型疫苗奠定基础。 1材料和方法 材料 DH5α和BL21菌株由本实验室保存;pET28a质粒由范雄林博士惠赠; 带HBV截短C基因和preS1基因的质粒pDE22CtpreS1w由本实验室构建; Taq DNA聚合酶、限制性内切酶(TaKaRa公司);胶回收试剂盒(上海华舜公司);T4 DNA连接酶(上海生物工程公司);Ni2+NTA凝胶亲和层析柱(Qiagen公司);HRP标记羊人IgG，DNA 分子标准和低分子蛋白质标准(华美生物工程公司) 方法 引物设计与合成根据GenBank中的HBV C基因和前S1基因序列，利用生物学信息软件设计其扩增引物，以扩增C基因编码蛋白N端155个氨基酸的基因片段和前S1全基因. 上游引物P1：5′GCGGAATTCATGGACATTGACCCGTATAAAG3′，含EcoRⅠ酶切位点；下游引物P2：5′GCGAAGCTTTTAACCCAGCCCGAATGCTCC3′，含HindⅢ酶切位点和终止码TTA. 交上海生物工程公司合成。 以pDE22CtpreS1w质粒为模板进行PCR扩增，反应体系为：质粒（1∶100稀释）5 μL，10×Buffer 5 μL ，10 mmol/L dNTPs 4 μL，P1（100 pmol/L）2 μL，P2（100 pmol/L）2 μL，Taq DNA聚合酶 2 μL，用超纯水补至终体积50 μL. 反应条件：预变性94℃ 5 min；94℃ 1 min，56℃ 50 s，72℃ 1 min，共进行30个循环，最后在72℃延伸10 min. 取5 μL反应产物进行琼脂糖电泳分析。 组质粒的构建及鉴定连接、转化、重组质粒鉴定均参照文献［1］进行，将酶切鉴定正确的重组质粒交由北京三博远志公司测序。 质粒，转化大肠杆菌BL21，挑取单菌落（同时设空载体质粒转化的大肠杆菌BL21为对照），置5 mL LB培养液中（含卡那霉素50 g／L），37℃振摇过夜，次日1∶100的稀释度加入5 mL LB培养液中37℃振摇3 h后，测定A600 nm约～时加入IPTG至终浓度1 mmol/L，37℃继续振摇4～5 h，离心收菌. 用PBS(pH )悬浮离心收集的细菌，加入溶菌酶至终浓度 g/L，4℃放置20 min，超声破碎，4℃下10 000 g离心10 min，收集上清和沉淀. 将菌体沉淀、裂解上清、裂解沉淀和空质粒转化菌分别加入等体积的2×样品缓冲液，沸水中加热5 min，12 000 g离心5 min，取上清，每孔15 μL进行SDSPAGE电泳，电泳在恒压下进行（浓缩胶中为100 V，分离胶中为120 V）. 电泳结束后，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝染色液中染色2 h，然后用脱色液脱色至背景清晰. 薄层扫描分析目的蛋白表达带占菌体蛋白百分比。 表达蛋白参照Qiagen公司镍离子亲和层析柱(Ni2+NTA)操作说明进行. 首先离心收集1 L诱导宿主菌，冰浴15 min；按5 L/kg湿菌的比例加入含8 mol/L尿素 的Buffer B（pH ），室温下轻轻搅拌使细菌裂解至溶液清亮，4℃下10 000 g离心收集上清，弃去沉淀；将1 mL Ni2+NTA树脂悬浮液与一定量清亮裂解上清于室温轻柔摇动混匀(100 min摇动15～60 min) 后，将其混合液装柱；依次用 Buffer C（pH ）， Buffer D（pH ）， Buffer E（pH ）洗脱，分别收集洗脱液. 取各部分样品进行SDSPAGE分析。 Blot检测表达蛋白将纯化蛋白进行SDSPAGE凝胶电泳，然后将蛋白质