龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞内STAT3通路的调控研究.docVIP

龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞内STAT3通路的调控研究 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞内STAT3通路的调控研究 1 1、材料与方法 2 2、结果 5 3、讨论 6 文2：饮料通路的精耕细作 8 一、何谓通路精耕 8 二、通路精耕的内容与表现形式 8 三、通路精耕的实施 9 四、通路精耕的组织、实施及检查 12 五、通路精耕的实施条件 12 参考文摘引言： 13 原创性声明（模板） 14 文章致谢（模板） 14 正文 龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞内STAT3通路的调控研究 文1：龙胆泻肝汤对人HaCaT细胞内STAT3通路的调控研究 龙胆泻肝汤源自《医方集解》，是临床中常用方剂之一[1]。原方由龙胆草、栀子、黄芩、泽泻、木通等十味药物组成，龙胆草为君，栀子、黄芩为臣，其余为佐，诸药同行，共奏清泻肝胆实火、清利肝经湿热的功效。近年来，该方广泛用于临床实践，对银屑病也展现出较好的疗效[2]，但其作用的分子机制尚不清楚。表皮角质形成细胞增殖异常是银屑病皮损处病理特征之一[3]。本研究利用人永生化表皮细胞HaCaT，分析了龙胆泻肝汤对表皮形成细胞凋亡的影响以及机制。 1、材料与方法 材料 HaCaT细胞株购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。 龙胆泻肝汤：龙胆草6g、黄芩9g、山栀9g、泽泻12g、车前子9g、生地黄20g、当归8g、柴胡10g和甘草6g。DMEM培养基、胰蛋白酶与胎牛血清：Gibco公司。Westernblot用一抗：CST公司，辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗：Abcam公司。STAT3荧光素酶报告质粒：上海碧云天生物技术有限公司，内参质粒pRL-TK内参质粒：Promega公司，Lipofectamine2000:ThermoFisher公司，RIPA裂解液与细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司，Trizol:ThermoFisher公司。cNDA逆转录试剂盒：天根生化科技有限公司。LightCycler480SYbrGreenIMaster:ROCHE公司，双荧光素酶报告检测试剂盒，Promega公司。PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司。 生物安全柜（苏净安泰，型号：BSC-1600IIA2）、CO2培养箱（Thermo，型号：3111）、倒置显微镜（OLYMPUS，型号：CKX53）、实时定量PCR仪（ROCHE，型号：LightCycler480Ⅱ）超低温冰箱（Thermo，型号：702）、微孔板发光检测仪（Berthold，型号：LB960）低温高速离心机（Thermo）、电子天平：Startorius公司，型号：BSA2202S) 方法 取龙胆泻肝汤中药成分加相当于药材量10倍体积的去离子水浸泡2h，回流提取1h并过滤，药渣再加10倍量去离子水继续提取1h，合并2次滤液，浓缩定容至每mL相当于1g的原中药材的药液，离心去渣，过滤除菌，4℃冰箱保存备用。细胞培养时稀释到相应终浓度。 HaCaT细胞株在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中于37℃、5%CO2贴壁培养，隔天换液。待细胞融合约90%时，吸去培养液，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，加入适量胰酶，37℃放置5min，吸掉胰酶，加入相当2倍体积胰酶的培养液终止消化，反复吹打并转移至15mL离心管，800转/min，离心3min，弃上清，细胞沉淀重悬后以1∶3的比例接种到新培养瓶中。实验时取状态较好的对数生长期细胞。 将细胞铺到96孔板中，24h后细胞密度达到约90%。参照说明，分别加入适量无血清无抗生素的培养基，Lipofectamin2000转染试剂和质粒混合物（STAT3质粒与pRL-TK质粒9∶1混合）混匀，室温放置10min。将配制好的Lipofectamin2000转染试剂和质粒混合物（STAT3质粒与pRL-TK质粒9∶1混合）加入到细胞生长的培养板或培养皿中。 按照Promega公司提供的双荧光素酶报告基因分析系统说明书进行操作。吸去培养液，PBS冲洗细胞1次，每孔加入被动裂解液（PLB）细胞裂解液20μL，反复吹打，冰上放置10min，再吹打细胞，收集细胞裂解液，通过生微孔板发光检测仪进行双荧光素酶活性测定。以萤火虫荧光素酶的活性与海肾荧光素酶活性的比值表示被检测的质粒在转染细胞后所测得的实际荧光素酶的相对活性。实验重复4次。 将药物处理的HaCaT细胞吸除培养液，用PBS冲洗2次；细胞刮刷刮瓶底细胞，然后用移液器将细胞碎片转移至管中，4℃、5000转/min、离心5min，弃上清，使用RIPA裂解液冰上裂解提取细胞总蛋白。 细胞核蛋白的提取参照说明