甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响分析.docVIP

甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响分析 目录 TOC \o 1-9 \h \z \u 目录 1 正文 1 文1：甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响分析 1 1、材料与方法 2 2、结果 6 3、讨论 7 4、结论 8 文2：二甲双胍对胰岛素抵抗的防治作用 8 1 减肥作用 9 2 对I的作用 9 3 对血脂的调节作用 10 4 讨论 11 参考文摘引言： 11 原创性声明（模板） 13 文章致谢（模板） 13 正文 甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响分析 文1：甲基莲心碱对胰岛素抵抗的HepG2细胞降糖的影响分析 现代研究发现，糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌代谢障碍性疾病，其患病率在逐年上升，严重危害人体健康[1]。2型糖尿病最主要的致病因素是胰岛素抵抗[2]。而自噬水平的过度激活可促进凋亡的发生，造成细胞不必要的损伤[3]，这可能是导致胰岛素抵抗的原因之一。2型糖尿病中引起β细胞数目减少的主要原因就是细胞凋亡[4]。近年来市面上现有的口服降糖药主要有双胍类、胰岛素增敏因子、α-葡萄糖苷酶抑制剂等，这些药物通过延缓和减少机体对葡萄糖的吸收、提高组织器官对胰岛素的敏感性等来治疗2型糖尿病[5]。目前并非所有患者均适用已有的降糖药，这些降糖药在临床治疗中存在一些局限性，故需要开发适用范围更广的降糖药物。 甲基莲心碱是从睡莲科植物莲的成熟种子绿色胚芽中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱，有着广泛的药理作用[6]。甲基莲心碱具有降低血糖的作用，并可用于治疗实验中建立的2型糖尿病大鼠模型。目前与甲基莲心碱相关降血糖的实验研究较少，在这些已有的研究中，其实验研究对象多为大鼠模型。本实验从新的方向进行研究，建立与以往实验不同的实验模型，以研究甲基莲心碱的降糖活性。 1、材料与方法 实验细胞 人肝癌细胞株HepG2，购于美国模式菌种收集中心(ATCC)细胞库。 实验药物 甲基莲心碱购自上海源叶生物科技有限公司[批号:b20598-20mg，纯度，高效液相色谱法(HPLC法)≥98% 试剂和仪器 DMEM高糖培养基(美国HyClone公司);青霉素-链霉素混合液(北京博奥拓达科技有限公司);胎牛血清(美国O-RIGIN公司);磷酸盐缓冲液(北京博奥拓达科技有限公司);胰岛素(诺和灵R);胰蛋白酶-EDTA溶液(北京博奥拓达科技有限公司);葡萄糖检测试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司);cck-8(日本同仁化学研究所);细胞培养瓶(美国Fishecientific公司);96孔板(美国Corning公司);BCA蛋白定量试剂盒(凯基生物科技有限公司);抗体mTOR、pmTOR、自噬微管相关蛋白轻链(LC3)、泛素结合蛋白(p-P62)、β-actin;Blockingone(日本NacalaiTesque公司);Solution1、Solution2(日本TOYOBO公司);10×TBST封闭洗涤缓冲溶液、10×TBS封闭洗涤缓冲溶液(北京普利莱基因技术有限公司);分离胶缓冲液、浓缩胶缓冲液(北京普利莱基因技术有限公司) R200D型分析天平(瑞士METTLER公司);AIRTECH超净台;IX71倒置显微镜(日本Olympus公司);SC3610型低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司) 建立胰岛素抵抗模型 HepG2细胞冻存于液氮储存系统中，使用时取出进行传代培养。将取出的HepG2细胞置于35℃的水浴中复苏。在超净台中将离心沉淀后的细胞装入含有DMEM高糖培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素混合液的细胞培养皿中。混合后将细胞培养瓶放入孵育箱中培养，待细胞贴壁生长后取出培养瓶，用磷酸缓冲液(PBS)清洗细胞，加入适量的胰蛋白酶-EDTA溶液消化贴壁的细胞50s，用含血清的培养基使细胞停止消化。将处理好的细胞转移至离心管中在800min的转速下离心，离心结束后倒掉上部培养基加入新培养基，用移液器混匀使之成为均匀的细胞混悬液。将细胞混悬液分装入新的培养瓶中继续培养。 将胰岛素母液稀释为10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L、10-8mol/L5个浓度。取96孔板，将HepG2细胞均匀接种于96孔板中，每列6个复孔作为一组，每组加入不同含浓度的胰岛素和正常组。依此操作做相同的6个实验模型，每个实验模型培养时间分别为12h、24h、36h、48h和60h。培养结束后用葡萄糖测试盒测定细胞的耗糖量。 精密称取甲基莲心碱溶于二甲基亚砜(DMSO)中配成浓度为1mol/L的母液，取处于对数生长期的HepG2细胞，在显微镜下计数1×105个/ml细胞接种至96孔板，每孔加100μl细胞混悬液。