质粒DNA的提取与酶切鉴定.pptxVIP

会计学;一. 实验目的和要求 1、了解质粒DNA的特性，掌握碱裂解法从大肠杆菌细胞中分离、提取质粒DNA的方法； 2、掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法； 通过本实验了解限制性内切酶在分子生物学研究中的意义与作用。;二.实验原理 1、碱裂解法小量制备质粒DNA：碱裂解法是基于线性大分子染色体DNA与小分子环形质粒DNA的变性复性的差异达到分离目的的，在pH12.0～12.6的碱性环境中，线型染色体DNA和环型质粒DNA氢键会发生断裂，双链解开而变性，但质粒DNA由于其闭合环型结构，氢键仅发生部分断裂，而且其互补链不完全分离；当将pH值调节到中性并在高盐浓度下，已分开的染色体DNA互补链不能复性而交联形成不溶的网状结构，通过离心，大部分染色体DNA、不稳定的大分子RNA和蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去，而部分变性的闭合环状的质粒DNA在中性条件下很快复性，恢复到原来的构型，呈可溶性状态保存与溶液中，离心后上清中便含有所需要的质粒DNA。; 2、限制性内切酶：又称为内切酶或限制酶，是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶，是体外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、III型三大类，Ⅰ类和III类限制性内切酶，在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖A