CRISPR技术发展和原理.docxVIP

CRISPR技术 朱东升（选择写CRISPR技术的初衷是因为2018年影响很大的贺建奎用CRISPR技术编辑人类胚胎进行繁殖的事件，本人希望详细地了解、介绍这项技术，全面地剖析它的好坏利弊。） 【1】技术发展和原理 本人在网上搜集翻阅了大量资料文献，尝试过自己重写一遍但是感觉都不如找到的这篇文章讲得鞭辟入里、浅显易懂，所以这部分基本引用的都是这篇文章： /view/94bd620382c4bb4cf7ec4afe04a1b0717fd5b315.html 作者在开头提到了这是她《基因分子生物学》课程的一篇作业，所以我没把这篇列在文末的参考文献，不过把她这篇文章内提到的参考文献都列在文末了。 一、 初露锋芒，刮目相看 ——细菌也有“高级”的获得性免疫系统 到底什么是CRISPR？ ——它的中文名很长很拗口，和英文一样不知道怎么念，却能顾名思义，了解其基因序列上的特点，那就是——成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）。 既然是讲故事就把关子卖到最后，讲到那里再告诉大家这些定语的含义。 是个啥？ 任何伟大事物的开端（原谅我下此断言，不过看溢美之词甚盛【21】【22】，也不算过分），任何风云人物的发家，任何跌宕故事的开始，总是不起眼“其貌不扬”的，我们的主角CRISPR系统也不例外。 很多综述【3】里都把CRISPR的起源说在了1987年，还是从我们最熟悉的E.coli,最经典的K-12株系中发现的，但是本着挖祖坟的心态费劲找出这篇26年前的文章【7】来考据，却发现似乎其中只有这一点是与我们的CRISPR沾边的，就是这个回文序列。 图1 最初在大肠杆菌中发现的CRISPR序列迹象【7】 “叫”个啥？ 这个发现纯属偶然，也没有引起包括发现者本身太大的重视，甚至这种特征序列都没有一个名字，直到2002年，在通过计算机操作发现很多原核生物（真细菌和古细菌），都有类似被21-37bp的回文重复序列间隔开的非重复序列后，他才正式有了这个顾名思义的名字CRISPR，成簇的、规律间隔的、短回文、重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）【8】。并且除了这样的特征序列外，在他们的附近还有一写CRISPR-associated基因。也就是我们后来说的发挥大刀剪切作用和整合外源片段作用的一系列Cas蛋白。于是我们基本可以得到这样一张漂亮的模式图，并清楚了CRISPR系统中最重要的3大元件—spacer（白色方块），回文repeats（双三角），cas等基因。 图2 CRISPR特征序列模式图 “干“个啥？ 一开始，由于spacer序列种内保守，种间差异的特点，一度甚至现在【30】也在被用来鉴定菌株，回头看来虽然大材小用，但好歹也是广泛应用性的体现。 还是和大多数科学发现一样，CRISPR系统的发现经历了一个搞清：是个啥？——“叫”个啥？—— “干”个啥的过程。 现在我们已经知道他长得什么样子什么特点，可是关于这一奇怪序列是干什么的，在很长一段时间里众说纷纭。 功能显然和spacer的序列特异性有关，那么是chromosomal rearrangement？ modulation of expression of neighboring genes,target for DNA binding proteins,？replicon partitioning,还是DNA repair？ 都有道理不过只是猜测，直到2005年，3个课题组独立的数据分析表明——这些spacer是外源DNA来源的，病毒或者质粒。【3】于是才让大家想，外源DNA，这会不会参与了防御外来DNA呢？ 2007年Streptococcus thermophilus的实验证实了这一猜想，于是经过不断完善，有了我们下面这张华丽丽的示意图，一个只能用elegant形容的漂亮的免疫过程。 漂亮的获得性免疫系统——谁说这是“高等”生物的专长？ 如何解说这个漂亮的系统，我想参照我们学过的抗原抗体免疫很容易理解，这里用一个通俗的比喻（如下图3）简单讲讲。 外源DNA就是坏蛋，而抓住坏蛋特征这一最核心的步骤之一则是——靠的Cas复合体将片段特征proto-spacer制作成spacer，整合进CRISPR序列中，形成记忆。于是接下来的2次免疫中，spacer便可以快速bingding到proto-spacer上。完成这一target的精确打击过程。干掉入侵者。