病毒滴度测定.docVIP

病毒滴度测定 有好多名词都用来描述病毒溶液的滴度。 1．VP（病毒颗粒）或OPV（光学颗粒单位） 2．GTU（基因转移单位）或转导颗粒（BFU即蓝点形成单位，与GTU近似） 3．PFU（空斑形成单位） 4．TCID50（50%组织培育感染剂量） 不同样的观点缘于不同样的滴度测定方法，这些方法包含2类：物理方法（VP）和生物学方法（GTU、 PFU、TCID50）。 1．测定VP的方法是测定病毒颗粒在260nm处的吸光度（病毒DNA和蛋白的总吸光度中主 要为DNA），1个OD值相当于×1012个病毒颗粒。用这类方法进行测定在各个实验室中都较 为牢固，但它不能够区分感染性和缺点性病毒颗粒。所以这类方法只好供给病毒的量，至于质， 比方可否含出缺点性颗粒则没有考虑在内。 2．GTU则测定感染后能表达报告基因的细胞数目。这个过程中，病毒将DNA转入细胞，在 一个感染周期结束前立刻测定表达报告基因的细胞。若是重组腺病毒含有报告基因如GFP 或LacZ等则能够用这类方法进行测定，病毒保存液平时不用这类方法来进行描述。 3．PFU是测定腺病毒滴度最早的标准方法，主要测定单层细胞培育中病毒裂解空斑的形成。 空斑形成需要好多个感染周期，获得最后结果平时需要三个礼拜。一般来说，这类方法获得 的结果极少能在其他实验室重复，即便在同一实验室内，不同样技术员操作也极少能获得同样 的结果。 4．TCID50已被用于测定好多种病毒的滴度，但以前其实不用于腺病毒。病毒稀释液与细胞 96孔板进行培育，尔后监测每孔可否CPE。TCID50方法相对PFU方法而言有几个长处，如速度是PFU的2倍，结果更具猜想性，在不同样操作个体间也更牢固。 全部生物学方法所获得的结果在不同样实验室之间经常有所差别，它主要与病毒感染方法有 关。好多要素如加入的病毒储蓄液的量、管子的种类、培育的时间、细胞和培育液的量等都 会影响结果。近来，出现了两种测定病毒滴度的改良方法。一种是用更小体积的病毒液进行 感染并在感染过程中不停晃动培育板（Mittereoler等，1996）；另一种方法规在感染时将 培育板进行离心（1000RCF90分钟）（Nyberg-Hoffman等，1997）。这两个实验室所获得的 结果更为牢固，并证明以前的方法低估了病毒保存液中感染性病毒颗粒的数目。迄今为止， 还没有一种方法被控制机构认定为测定滴度的标准方法。 对于同一管病毒保存液，不同样的方法所获得的结果经常相差100倍以上，典型的数据见表6。 全部结果都可是大体的，目前最有效的生物学方法（离心法感染）能检测到1个感染性颗粒 /2个颗粒。下一部分，我们将详细描述3种不同样的测定病毒滴度的方法。选择滴定方法要 考虑的重点要素包含可重复性、牢固性、敏感性、易用性和耗时。无论选择那种方法，稀释 和滴定过程一定重复操作以获得精确结果。一般来说，用TCID50方法获得的病毒保存液的 滴度应为： 106~107第一代细胞经冻融后 108~109100倍数目的细胞经过冻融后 1010~1011用氯化铯方法纯化后 表6：各滴度测定方法特点 方法种类时间可重复性滴度*评注 VP物理学方法2小时好5×1012 GTU生物学方法2天可变2×1011 PFU生物学方法21天变化很大5×1010传统方法 TCID50生物学方法10天可变×1011昆腾公司标准方法 以VP法测得的5×1012的病毒保存液为标准 5.8.1nm（VP/ml） 这类方法可是经过DNA量来表示病毒滴度。相关系数为×1012/OD260单位。因为大多数分 光光度计在OD值小于时不够精确，而样品准备过程中又最少要稀释10倍，所以若是OD值 大于，我们能够预计病毒量大于1012。这一方法只可用于测定氯化铯纯化后溶于缓冲液中 的病毒，因含血清培育基会搅乱吸光度。同时，它也要求病毒浓度足够高，而且不含缺点性 颗粒。 1．4℃消融病毒保存液。 2．在无菌超净台内用病毒裂解液（VLB）（%SDS，10mMTris，1mMEDTH）准备二个病毒稀释 度。 最小需要量为：s 病毒裂解液 病毒 稀释度 52ul 52ul 1 ：2（稀释液 1） 168ul 42ul 1 ：5（稀释液 2） 注意：病毒滴度高时（ 1013/ml）用1：10和1：20 稀释度，滴度低时用低稀释度，保证OD 值在~之间。 3．56℃震荡培育10分钟。0ufgbjf 4．准备1ml含有VLB和透析缓冲液的空白比较溶液， 比率同上，以缓冲液取代病毒裂解液。 5．测定260nm处吸光值： 稀释液1再稀释1：5，为稀释液3。 稀释液2再稀释1：5和1：10，分别为稀释液4和稀释液5。 测定稀释液5（2次）、4、3的OD260，取此4值的平均值作为最后结果。 比方 1．将450ulVLB和50ul稀释液即透析缓冲