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病毒转染原理及步骤 病毒转染原理及步骤 在细胞相关的实验操作中，对于一些按老例方法难以转染甚至没法转染的细胞，经过病毒介导的实验可以大大提升基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 病毒转染包含以下步骤：1成立载体2包装提纯病毒3感染靶细胞。以慢病毒为例。 慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺点I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。差别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均拥有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也特别深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，进而达到长久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多各种类的细胞，进而达到优异的的基因治疗收效，在xx已经展开了临床研究，收效特别理想，所以拥有广阔的应用远景。 病毒转染原理及步骤 一、慢病毒载体成立原理： 慢病毒载体的包装系一致般由两部分组成，即包装成分和载体成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而成立，可以反式供给产生病毒颗粒所必要的蛋白；载体成分则与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，同时拥有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基 因。将包装成分与载体成分的多个质粒共转染包装细胞，即可在细胞上清中收获携带目的基因的复制缺点型慢病毒载体颗粒。 慢病毒表达载体包含了包装、转染、牢固整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可供给全部的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的全部辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培育基中，离心获得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞此后，经过反转录，整合到基因组，进而xx的表达效应分子。 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等,能大大提升目的基因转导效率，并且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增添，这就为RNAi，cDNAxx以及报告基因的研究供给了一个有益的路子。对进行稳转细胞株的精选，为活体动物模型实验供给高质量的包含目的基因的病毒液供给基础。 病毒转染原理及步骤 二、慢病毒载体成立及包装流程： （一）实验流程（1和2为并列步骤） 慢病毒过表达质粒载体的成立 设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采纳 xxKOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒也许文库） 调取目的基因CDS区（codingsequence）连入T载体。将CDS 区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。 慢病毒搅乱质粒载体的成立 合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒搅乱质粒 载体 慢病毒载体的包装与浓缩纯化 制备慢病毒穿越质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载 体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完整培育基，培育24和48h后，分别采集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液经过超离心浓缩病毒。 （二）实验资料：慢病毒载体、包装细胞和菌株 该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2,pMD2G,pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。此中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。 病毒转染原理及步骤 细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培育基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培育生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 三、慢病毒转染方法 （一）慢病毒转染贴壁方法 1、慢病毒转染前18-24小时，将以1×105/xx铺到24xx板中。使细胞在慢病毒转染时的数目为2×105/xx左右。 2、第二天，用含有6μg/mlpolybrene的2mlxx替代原培育基， 加入适合病毒悬液。37℃孵育。 3、(对polybrene毒性敏感的选作此步骤)4小时后加入2mlxx培 养基以稀释polybrene。 4、持续24小时，用xx培育基替代含有病毒的培育基。 5、持续培育。若是慢病毒含有，一般转染48小时后可见显然荧 病毒转染原理及步骤 光表达，72小时后更加显然。如需FACS检测转染效率，可在转染 72-96小时进行。若是慢病毒含有抗性基因并且需要加药精选，可以在转染3-4天后开始加药。 （二）慢病毒转染实验方法 1、在2×105/ml悬浮细胞中加入polybrene至6μg/ml和适合 病毒，充分混匀。37℃孵育。也许150g室温离心4小时(选作， 部分难转染的细胞系采纳此步骤可以提升转染效率)。 2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时