细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测.docxVIP

PAGE PAGE 1 细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测 技术指南 Technical Guidelines on Biofilm Cultivation, Examination and Resistance Evaluation (征求意见稿) 前言 为培养与观测细菌生物被膜、评测细菌生物被膜耐药性等工作，制定本技术指南。 本指南是对运用体外静态生物被膜、流式生物被膜、最小抑菌浓度检测等技术进行细菌生物被膜培养、观测和耐药性评测的指导性文件，可供实验室细菌生物被膜培养与观测工作、细菌生物被膜耐药性评定等工作为参考。 本指南为首次发布，今后将根据细菌生物被膜实验要求及技术发展情况适时修订。 本指南由南方科技大学医学院负责管理，由南方科技大学医学院杨亮课题组负责具体技术内容的解释。为了提高指南质量，请各单位在使用过程中，总结经验和积累资料，及时将发现的问题和意见反馈给南方科技大学医学院杨亮课题组，以供后续修订时参考。联系方式：广东省深圳市南山区西丽学苑大道1088号，邮编：518055；E-mail：yangl@sustech.edu.cn。 本指南起草单位为南方科技大学医学院。 本指南主要起草人：杨亮，邓音乐，王晓雪，梁海华，瞿涤，钱国良，马旅雁，吴卫辉，白芳，徐振波，刘洋，蔡曌，段湘科，张莹丹，刘茜，谭玉龙。 细菌生物被膜的培养、观测和耐药性评测技术指南 1 适用范围? 本指南规定了细菌生物被膜培养、观测和耐药性评测技术的实验条件要求、实验设计、实施与验证等技术要求。 本指南可作为实验室细菌生物被膜培养与构建、观测与定量、以及耐药性评估等工作的技术依据。 根据《中华人民共和国专利法》，对于本指南中所涉及专利技术（US9988380B2，U2，ZL201711231930.8，CN110974838A）的使用，需获得专利权所有人书面许可。 2 术语和定义 2.1?生物被膜：指细菌粘附于生物或非生物基质表面，分泌胞外多糖、蛋白质、胞外DNA等，将细菌细胞保护于其中而形成的膜状细菌群落。 2.2 交叉感染：细菌或其他微生物从一种物质或物体转移到另一种物质或物体并产生有害影响的过程。 2.3 Colony Forming Unit(CFU): 菌落形成单位，是一种活细菌细胞数量的测量方法，以CFU/mL为单位。 2.4 群体感应：指一种细菌细胞间的信号转导系统，群体感应在多种致病菌中控制毒力因子的合成。 3 细菌生物被膜培养方法与技术标准 以下生物被膜培养方法与技术标准均以铜绿假单胞菌为模式菌株撰写，其他菌种培养以及实验条件可按需求适当调整。 3.1 体外生物被膜培养(in vitro static biofilm) 3.1.1 体外静态生物被膜培养方法-孔板培养法 准备以下材料： 无菌96孔板（或24孔板, Nest/Corning）； 无菌储液器； 100uL排枪移液器（或1mL移液器）； 15 mL无菌摇菌管； 100uL（或1mL）移液器枪头； LB培养基（可按需使用其他培养基）； 所需菌株； 废液桶； 75%酒精； 无菌ddH2O； 无菌生理盐水； 培养步骤如下： 首先将LB培养基和移液器枪头在121℃高温高压灭菌15-30分钟，取出并将枪头干燥备用。将目标菌株接种至适当体积的LB培养基（例：如所需菌量不多，可接种2mL；所需菌量须以最终所需菌液体积计算）中，按所需温度（例：铜绿假单胞菌需37℃或丁香假单胞菌需30℃等）200rpm摇晃培养过夜。在无菌操作台中，用新鲜培养基将菌液稀释至OD600nm=0.01-0.05，将稀释好的菌液倾倒入无菌储液器，用排枪移液器将100uL稀释菌液加入96孔板孔洞中（或1mL移液器将1mL稀释菌液加入24孔板孔洞中），每株菌至少三个重复。将加入菌液的孔板在所需温度下静置培养至少16小时，以形成生物被膜。生物被膜形成后，移除孔洞中所有菌液，用150 μL ddH2O（结晶紫染色）或无菌生理盐水（死活菌荧光染色）洗两次，移除所有液体，生物被膜生长于孔壁上。 孔板培养法技术要点： 所有操作须严格遵守无菌操作流程，在操作过程中注意须使用灭菌器具并用酒精消毒操作台以及所使用的器具，避免交叉污染； 在将菌液加入孔板前，轻轻摇晃储液器将菌液混合均匀，并用排枪反复轻轻吹打菌液，以减小实验误差； 孔板培养生物被膜需保证培养后孔洞内剩余菌液体积基本一致，培养时需用透气封口膜密封孔板防止液体蒸发； 移除废液以及清洗生物被膜时须注意不可用枪头触碰生物被膜，以保证生物被膜完整性。 3.1.2体外动态生物被膜培养方法-玻璃珠培养法 准备以下材料： 无菌24孔板； 无菌储液器； 1mL移液器 15 mL无菌摇菌管； 1mL移液器枪头； LB培养基（可按需使