Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告.docVIP

Folin-酚试剂法测蛋白质含量测定实验报告 生物化学实验报告 姓 名： 学 号： 专业年级： 组 别： 生物化学与分子生物学实验教学中心 质的含量。 三、材料与方法：以流程图示意 1、材料：?样品：健康人的血清（稀释300倍）?试剂：牛血清蛋白标准液（200μg/ml）、碱性的硫酸铜溶液、蒸馏水、Folin-酚试剂?仪器及器材：V-1100型分光光度计、恒温水浴箱、试管6只、试管架、加样枪、加样枪架、加样枪头 2、方法：反应体系设置 双缩脲反应 Folin-酚反应 比色测定 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 牛血清蛋白标准液 - 0.2 0.4 0.6 0.8 - 样品液（稀释300倍） - - - - - 0.5 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 碱性硫酸铜溶液 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质的含量（μg/ml） 0 40 80 120 160 待测 取6支试管编号1~6，按下表依次加入试剂并混匀，室温放置10min。 表格 SEQ 表格 \* ARABIC 1 Folin-酚试剂定量蛋白质实验步骤 往6支试管中分别加入Folin-酚试剂0.20ml，在2s内立即混匀。40℃水浴加热10min后，冷却至室温。 用V-1100型分光光度计以500nm波长比色，用1号管做空白，测量各管吸光度值并记录，每管测量3次。 数据处理，绘制标准曲线，计算实验结果。 结果与讨论： = 1 \* GB3 ①结果：实验数据、现象、图谱； = 2 \* GB3 ②讨论：以结果为基础的逻辑推论，并得出结论。 结果 实验现象： 加入蒸馏水、蛋白样品和碱性硫酸铜溶液后，溶液均呈无色。 加入Folin-酚试剂后，溶液均呈黄色。 图1 水浴前各试管溶液颜色 水浴后，1号试管溶液呈无色。2号试管到5号试管溶液呈蓝色，且颜色逐渐加深。6号试管溶液颜色介于4号与5号之间，更接近于5号。 图2 水浴后各试管溶液颜色 实验数据记录与分析 测定次数 各管A值 2 3 4 5 6 1 0.050 0.088 0.128 0.144 0.142 2 0.049 0.085 0.125 0.144 0.142 3 0.047 0.084 0.124 0.143 0.142 各管平均值 0.049 0.086 0.126 0.144 0.142 表格2 500nm波长吸光度值记录 1 2 3 4 5 C（μg/ml） 0 40 80 120 160 A（吸光度） 0 0.049 0.086 0.126 0.144 表格 3 绘制标准曲线数据表 标准曲线图 实验结果计算：由标准曲线图可得，标准曲线方程为y=0.001x。由实验测得样品管（6号试管）的吸光度为0.142，即y6=0.142，代入标准曲线方程中可求得C6’=0.142/0.001=142μg/ml。即样品管中的蛋白质浓度为142μg/ml。由于血清被稀释了300倍，在实验中根据化学定量原则再稀释2倍。因此，健康人血清中蛋白质浓度C6=142*300*2=85200ug/ml=85.200g/L。最终通过实验测得健康人血清中蛋白质浓度为85.200g/L。 分析 最终实验结果超出正常范围（正常人血清蛋白浓度范围为60~80g/L）。可能的原因有： 酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用,导致蛋白质偏高。 实验操作不当。 从标准曲线图来看，前四个点基本在一条直线上，第五个点偏差较大。由此猜测第五支试管的吸光度误差较大，导致实验结果偏大。 第五、六支试管与前四支试管所使用的分光光度计不是同一台，而分光光度计是一种精密仪器，更换仪器会导致吸光度测量上有较大误差。 显色时间控制存在误差，各个样品的比色时间也无法完全一致。 取用蛋白质溶液可能不完全均匀，对结果造成影响。 试管可能未完全干燥，使标准液浓度不准确。 由标准曲线图可知，在一定的浓度范围内，吸光度值和蛋白质的浓度呈现正比例的关系。即在一定的范围内，蛋白质浓度越高，蓝色越深，吸光度值越大。通过这种正比例的关系，可以采用比色分析法，即通过测量待测液的吸光度值来获得蛋白质的浓度。 Folin-酚试剂法的优点有：1）灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10～20倍，双缩脲法灵敏100倍。2）操作简单快速，不需要复杂的仪器设备。 Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而试管中加入碱性硫酸铜试剂后导致溶液呈碱性，Folin-酚试剂不稳定。因此，Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中