植物基因克隆的方法.ppt

植物基因的克隆;基因：为RNA或蛋白质编码的核苷酸序列。 基因克隆：利用体外重组技术，将特定基因 和其它DNA顺序插入到载体中。 克隆目标：识别、分离特异基因并获得基因 的完整全序列，确定染色体位， 阐明基因的生化功能，明确其对 特定性状的遗传控制关系。 ;植物基因克隆的方法;方法一：根据已知基因的序列设计并合成一 对引物，从植物中提取DNA进行PCR扩 增，扩增的片段经纯化后连接到合适的 载体上，用酶切和序列分析检测重子， 并与已知基因序列进行比较。 ;;1.2根据DNA测序结果;;;方法：利用植物的表型差异或组织器官特异 表达产生的差异来克隆植物基因。此方法试图把表型与基因结构或基因表达联系起来，从而分离特定表型相关基因。不必事先知道基因的生化功能或图谱定位，根据基因的表达效应就直接分离该基因。 例子：利用表型差异从拟南芥中克隆出赤霉 素合成酶基因。 ;技术支持： 差别筛选法（differential screening） 扣除杂交技术（subtractive hybridization） mRNA差异显示技术（ mRNA differential display reverse transcription-PCR） 代表性差异显示（representational difference analysis） 抑制性扣除杂交（suppression subtractive hybridization）;局限性：;;1、将纯化的蛋白质进行氨基酸测序，推测可 能的mRNA序列,据此合成寡核苷酸探针从文 库中筛选编码基因。 2、将相应的编码蛋白制成相应的抗体探针， 从文库中筛选相应基因并克隆。 3、 根据mRNA序列设计相应的寡核苷酸引 物,对核DNA或cDNA进行PCR扩增. ;通过阳性克隆或PCR扩增产物的序列分析鉴定分离基因.;1.2根据基因的表型突变互补功能;例子;;原理;;定位克隆技术主要步骤; 3、构建目的基因区域跨叠克隆（contig） 以阳性克隆的末端作为探针筛选基因组文库，并进行染色体步行，直到获得具有目的基因两侧分子标记的大片段跨叠群。 4、目的区域的精细作图 通过整合已有的遗传图谱和寻找新的分子标记，提高目的基因区域遗传图谱和物理图谱的密度。 ;5、目的基因的精确定位和染色体登陆 利用侧翼分子标记分析和混合样品作图精确定位目的基因。接着以目的基因两侧的分子标记为探针通过染色体登陆获得含有目的基因的阳性克隆。 6、外显子的分离、鉴定 阳性克隆中可能含有多个候选基因，用筛选cDNA文库、外显子捕捉和cDNA直选法等技术找到这些候选基因，再进行分离，时空表达特点，同源性比较等分析确定目的基因。;定位克隆的优点和局限性;;;原理：;利用转座子克隆植物基因的操作步骤：;局限性;;此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！