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引物设计原则：
上下游引物要保守
为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的 100-200 片段进行 PCR
扩增。所以引物的选取也要非常的保守。
上下游引物的长度一般为 18-30bp 之间，且 Tm 值在 58-62℃之间，上下游引物的 Tm 值相差最好不超过 2℃。
确保引物中 GC 含量在 30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免 4 个或超过 4 个的 G 碱基出现。引物的3’端最好不为G 或/和 C。引物 3’端的 5 个碱基不应出现 2 个 G 或/和C。
避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。
跨外显子设计引物，用于区别或消除基因组 DNA 的扩增。探针设计的基本原则：
保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
Taqman 探针的长度最好在 25-32bp 之间，且 Tm 值在 68-72℃之间，确保探针的 Tm 值要比引物的Tm 值高出 5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
确保探针中GC 含量在 30-80%。
避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免 4 个或超过 4 个的G 碱基
探针的 5’端不能为 G，因为即使单个 G 碱基与 FAM 荧光报告基团相连时， 也可以淬灭 FAM 基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
Taqman 探针应靠近上游引物，即 Taqman 探针应靠近与其在同一条链上的 上游引物。两者的距离最好是探针的 5’端离上游引物的 3’有一个碱基。
避免探针与引物之间形成二级结构。
对于多重定量 PCR，例如 SNP 分型检测时，SNP 位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的 Tm 值应相近。
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