DB32∕T 4234-2022 水产品中副溶血性弧菌检测 实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法.docxVIP

ICS 67.120.30 DB32 江 苏 省 地 方 标 准 CCS B50 DB32/T 4234—2022 水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组 酶介导链替换核酸扩增法 Detection method for Vibrio parahaemolyticus in aquatic by real-time fluorescence recombinase-aid amplification 2022-03-18发布 2022-04-18实施 DB32/T 4234—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 I DB32/T 4234—2022 水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增法 1 范围 本文件规定了水产品中副溶血性弧菌检测实时荧光重组酶介导链替换核酸扩增（ recombinase-aid Amplification，RAA）法的试剂材料、仪器设备、检测程序、操作步骤、结果判定和报告、检出限及防 止污染措施。 本文件适用于水产品中副溶血性弧菌检测。 本文件适用于水产品副溶血性弧菌的快检初筛。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T 6682 GB 19489 分析实验室用水规格和试验方法 实验室 生物安全通用要求 GB/T 27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 重组酶介导链替换核酸扩增 recombinase-aid Amplification, RAA 一种利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程，在恒温下（一般为 37℃～42℃），进行核酸扩增的技术。 4 原理 RAA法利用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶代替了传统PCR的热循环解链过程。根据副溶血性弧 菌的特异性基因序列，结合荧光探针检测法对水产养殖及水体中副溶血性弧菌进行判定。经实时荧光RAA 扩增后，根据样品在30 min内是否出现扩增曲线，可判定样品结果。 5 试剂材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合 GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA 酶污染的容器分装。试剂材料有： 1 DB32/T 4234—2022 a) 探针和引物 根据副溶血性弧菌的特异性基因序列设计探针和引物。 表1副溶血性弧菌探针和引物 致病菌种类 引物探针名称 序列（5-3） 目的基因 上游引物tlh-F TTAGATTTGGCGAACGAGAACGCAGACATTACG tlh 下游引物tlh-R exo探针tlh-P AGATGTTGCCTGTATCAGACAAGCTGTCACCGA 副溶血性弧菌 TTACGTTCTTCGCCGCTGACAATCGCTTC[FAM-dT][THF ]A[BHQ-dT]ACAACCACACGAT-SpacerC3 b) 试剂 1） RAA反应缓冲液：20% PEG，280 mmol/L醋酸镁（MgAc2）。也可采用等效的商品试剂盒。 2）冻干酶制剂：1 mmol/L dNTP、90 ng/μL单链结合蛋白、120 ng/μL recA重组酶、30 ng/μL Bsu DNA 聚合酶、30 ng/μL ExoIII、100 mmol/L Tricine、20% PEG、5 mmol/L二硫苏糖醇、100 ng/μL肌酸激酶， 保存于 200 μL反应管中。也可采用等效的商品试剂盒。 3）阳性对照：副溶血性弧菌标准菌株ATCC17802，或含目的片段的DNA；阴性对照：非副溶血性弧 菌标准菌株，或不含目的片段的DNA；空白对照：无菌水。 6 仪器和设备 包括以下几种： a) 荧光检测仪：带有恒温（39℃±1℃）扩增功能的荧光检测仪。 微量移液器：0.1 μL～2.5 μL，1 μL～10 μL，2 μ L～20 μL，10 μL～100 μL，20 μL～200 μL， b) 100 μL～1 000 μL，并配备与移液器匹配的吸头。 c) d) e) 高速台式离心机：离心力≥12000 g。 恒温水浴锅或金属浴：100℃±1℃。 天平：感量 0.01 g。 7 检测程序 副溶血性弧菌实时荧光RAA检测程序见图１。 2 DB32/T 4234—2022 图 1副溶血性弧菌实时荧光 RAA检测程序 8 操作步骤 8.1 样品处理和增菌 水产品参照GB 4789