乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和绵羊）源性成分定性检测方法-实时荧光PCR法.pdfVIP

T/CNHFA 002—2022 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和绵羊）源性成 分定性检测方法 实时荧光PCR 法 1 范围 本文件规定了乳及乳制品中牛 （家牛、牦牛和水牛）、羊 （山羊和绵羊）源成分以及家牛、牦牛、 水牛、山羊、绵羊单一乳源成分的实时荧光PCR定性检测方法，方法的最低检出限为1% （配料质量比）。 本文件适用于乳及乳制品中牛 （家牛、牦牛和水牛）、羊 （山羊和绵羊）以及家牛、牦牛、水牛、 山羊、绵羊源性成分的定性检测，适用的产品类别包括液态乳 （巴氏杀菌乳、高温杀菌乳、调制乳、灭 菌乳、发酵乳）、乳粉（全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉、乳清粉）、婴幼儿配方乳粉 等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光PCR Real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，实现对起始模板的定 量及定性分析。 3.2 Ct 值Cycle threshold （Ct） 每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1 CTAB ：cetyltrithylammonium bromide ，十六烷基三甲基溴化铵。 4.2 cytb ：cytochrome b，线粒体细胞色素b 基因。 4.3 dATP ：deoxyadenosine triphosphate ，脱氧腺苷三磷酸。 4.4 dCTP ：deoxycytidine triphosphate ，脱氧胞苷三磷酸。 4.5 dGTP ：deoxyguanosine triphosphate ，脱氧鸟苷三磷酸。 4.6 DNA ：deoxyribonuleic acid，脱氧核糖核酸。 4.7 dNTP ：deoxyribonuleoside triphosphate ，脱氧核苷酸三磷酸。 4.8 dTTP ：deoxythymidine triphosphate ，脱氧胸苷三磷酸。 4.9 EDTA ：Ethylene diaminetetraacetic acid ，乙二胺四乙酸。 4.10 GH：Growth Hormone，生长激素基因。 1 T/CNHFA 002—2022 4.11 PCR ：polymerase chain reaction ，聚合酶链式反应。 4.12 Tris ：Tris （Hydroxymethyl ）aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 4.13 Taq：Thermus aquaticus，水生栖热菌。 4.14 UNG ：uracil N-glycosylase，尿嘧啶N-糖基化酶。 5 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染，应由具备资格的工作人员检测，所有生物安全防护的设施、 设备和安全管理的基本要求按照GB 19489有关规定执行。 6 方法原理 基于实时荧光PCR 的检测原理，采用哺乳动物通用和牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）、 以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分的特异性引物探针，对样品中提取的DNA模板进行 实时荧光PCR反应。根据反应结果判定羊乳样品中是否含有牛（家牛、牦牛和水牛）、羊（山羊和绵羊）、 以及家牛、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分。 7 仪器设备 7.1 实时荧光PCR 仪。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 7.3 分析天平：精度0.1 mg 。 7.4 水浴锅。 7.5 离心机