抗体工程概述.pptVIP

用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。 使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段，经过纯化即可获得目的抗体。 筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌， 第六十三页，编辑于星期日：十三点 十八分。 该项技术的优点: 将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如激素、酶、药物、随机多肽等的生产。 第六十四页，编辑于星期日：十三点 十八分。 噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际应用上具有很大意义。 第六十五页，编辑于星期日：十三点 十八分。 -d 细胞融合 -a -b -c -d Ag X Ag X’ ELISA HAT PEG Cell fusion Hybridoma cells 融合瘤细胞 （Subcloning） (确定只有一种细胞) d’ d a b c d a b c d’ + + + + + + + - X -d -c -b -a + - -d NS-1 骨 髓 癌 细 胞 B cell 脾 细 胞 分株培养筛选 筛选 单抗 传统抗体 (抗血清) 试验专一性 对 抗 原 的 反 应 无 法 分 辨 完 全 不 同 d 旧有抗原 d’ 新的抗原 第三十一页，编辑于星期日：十三点 十八分。 基因工程抗体 第三十二页，编辑于星期日：十三点 十八分。 第三十三页，编辑于星期日：十三点 十八分。 1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies) 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。 第三十四页，编辑于星期日：十三点 十八分。 构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。 构建重组表达载体 第三十五页，编辑于星期日：十三点 十八分。 克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。 人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。 第三十六页，编辑于星期日：十三点 十八分。 2 鼠单抗可变区的人源化 尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。 第三十七页，编辑于星期日：十三点 十八分。 第三十八页，编辑于星期日：十三点 十八分。 经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体） 第三十九页，编辑于星期日：十三点 十八分。 人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。 第四十页，编辑于星期日：十三点 十八分。 定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。 研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。 第四十一页，编辑于星期日：十三点 十八分。 小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。 小分子抗体有很多优点: 可以用细菌发酵生产，成本低;