植物生物工程实验二(植物DNA的提取).pptVIP

实验目的 了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤 掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法 掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法 了解PCR原理，熟悉操作步骤 掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法 第一页，共四十一页。 保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等 DNA提取的原则 实验原理（DNA提取） 第二页，共四十一页。 DNA存在部位 主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在 第三页，共四十一页。 基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法 DNA提取的方法 第四页，共四十一页。 在浓氯化钠溶液(1～2mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来. 分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种:①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA.②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA.③用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀 第五页，共四十一页。 CTAB法原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物 高盐溶液中（0.7mol/L NaCl），该复合物可溶的 有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质 上清加入乙醇沉淀DNA。 CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 CTAB 第六页，共四十一页。 CTAB提取缓冲液的经典配方 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl CTAB β-巯基乙醇 终浓度 100 mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) 0.1%（V/V）使用前加入 第七页，共四十一页。 SDS法 原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（55～65℃）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA SDS 第八页，共四十一页。 组份 Tris-HCl （pH8.0） 　EDTA （pH8.0） NaCl SDS 终浓度 100mM 20 mM 1.4M 2%(W/V) SDS提取缓冲液的配方 第九页，共四十一页。 DNA提取基本步骤 材料准备 细胞裂解 核酸分离纯化 核酸沉淀 核酸溶解保存 第十页，共四十一页。 基因组DNA 新鲜材料，低温保存 细胞培养时间不能过长 材料准备 第十一页，共四十一页。 基因组DNA 材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料－－液氮研磨 培养细胞－－蛋白酶K 细胞裂解 第十二页，共四十一页。 采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系 采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法 核酸分离纯化 第十三页，共四十一页。 多糖的去除： 多糖水解酶 蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等） 蛋白酶处理 多酚的去除： 加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70％的乙醇洗涤 第十四页，共四十一页。 预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀 加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀 晾干DNA，让乙醇充分挥发 核酸沉淀 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解 第十五页，共四十一页。 DNA质量检测 紫外分光光度计检测法嘌呤和嘧啶的