《高效液相色谱法测定扑热息痛的含量》实验指导书（模板）.pdfVIP

实验二 高效液相色谱法测定扑热息痛的含量 一、实验目的 1.熟悉高效液相色谱仪的基本构成和基本操作。 2.掌握利用外标法测定药品的实验方法。 二、实验原理 高效液相色谱的流动相是液体，与组分之间具有一定的亲和力，可通过改变 流动相的性质、极性、pH 等条件来提高分析的选择性。高效液相色谱的固定相 颗粒很细，黏度大，柱内压降很大，需要利用高压泵输送流动相。适用于分离沸 点高、极性强、热稳定性差、相对分子质量大和离子型的化合物，分析对象范围 比气相色谱要宽得多。 高效液相色谱仪主要由输液系统、进样系统、分离系统、检测器、记录及辅 助系统组成，其分析流程是：储液瓶中的溶剂由高压泵吸入色谱系统，然后输出， 经流量和压力测量后，导入进样器。被测物质由进样器注入，并随流动相通过色 谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并 记录色谱图。废液流入废液瓶。对于极性范围较宽的复杂混合物进行分离，可采 用梯度控制器进行梯度洗脱，这与气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱 改变温度，而高效液相色谱改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得 以分离。 高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程相同，高效液相色谱也是溶质在 固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。借助于溶质在两相间分配系 数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别，使不同溶质得以 分离。分配系数较小的组分不易被固定相阻留，较早的流出色谱柱，分配系数较 大的组分在固定相中滞留时间较长，较晚流出色谱柱。若一个含有多个组分的混 合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱， 达到分离目的。不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间 的分配系数、吸附能力、亲和力等是否存在差异；其次还与不同组分在色谱柱运 动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度大小、柱 的填充情况以及流动相的流速等有关。 流出色谱柱的各组分进入信号检测器，在记录仪上显示出各组分的色谱行为 和谱峰数值。测定各组分在色谱图上的保留时间（或保留距离），可直接进行组 分的定性，测量各峰的峰面积，即可作为定量测定的参数，采用工作曲线法 （即 外标法）测定相应组分的含量。 扑热息痛，学名为对乙酰氨基酚，其稀碱溶液在 257±1nm 波长处有最大吸 收，可用于定量测定。由于在其生产过程中，有可能引入对氨基酚等中间体，这 些杂质也有紫外吸收。如果用分光光度法测定，杂质会对含量测定的准确性造成 干扰。因此，可采用具有分离能力的高效液相色谱法将被测物和杂质分离开测定， 则杂质对被测物含量测定的干扰即被消除。 三、仪器，试剂及材料 仪器：高效液相色谱仪(含工作站)，色谱柱，SGE50μL 微量注射器。 试剂：对乙酰氨基酚母液(99.9%),甲醇-水(40:60)，扑热息痛片剂 四、实验步骤 1.系统开机准备 (1)接通电源 (2)打开电源，预热检测器。其中紫外检测器需要预热 30min 以上；荧光检 测器需要预热 1h 以上；示差折光检测器需要预热至少 24h 。 (3)打开高效液相色谱仪器主机的电源。 (4)启动计算机。 2.溶液配制 (1)标准品溶液配制：分别取含量为 99.9% 的对乙酰氨基酚母液(1mg/mL)1mL 、2mL、3mL、4mL 、5mL，加入标号 1-标号 5 的 100mL 容量瓶中，并用去离子 水稀释至刻度，摇匀。用注射器吸取标准 1mL，通过 0.45μm 滤膜，滤液转移 到 1.5mLEP 管中，分别标记。 (2)样品溶液配制：准确称取扑热息痛对照 50mg，置于 100mL 容量瓶中， 加入适量甲醇，振摇，使之充分溶解，并稀释至刻度，摇匀备用。取上述溶液 1.0mL，置于 50mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀即得。 3.工作站系统操作 (1)运行系统软件，登录用户。 (2)系统软件窗口进行检测方法和测量参数设定。 (3)将配制好的标号 1-标号 5 的标准品溶液，利用微量注射器进样，记录色 谱图的峰面积和出峰时间，绘制形成标准曲线。 (4)将待测样品放入样品池，开始进行测量，记录色谱图的峰面积。 (5)打开数据处理页面，进行