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口蹄疫诊断技术规程 1 .范围 本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及口蹄疫 病毒 RT - PCR 检测试验。正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清抗体水 平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和 RT - PCR 检 测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。 2 .正向间接血凝试验 2. 1 试剂 2.L1 纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清, 由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。 2.L2 稀释液，配制方法见附录 A。 2. 2 操作方法 2. 2.1 待检血清的灭活 将待检血清放人 56c 水浴中灭活 30 分钟。 2. 2. 2 待检血清的稀释 用稀释液将待检血清稀释成 1： 4, 1： 8, 1： 16, 1： 32, 1： 64, 1： 128, 1： 256, 1： 512 等 8 个稀释度。 2.2.3 阴、阳性血清的稀释 用稀释液将阴性对照血清稀释成 1:16,将阳性对照血清稀释成 1： 5120 2. 2. 4 加样 在干净的 V 型 96 孔 110。血凝板的第 1?8 孔加各稀释度待检血清50 HL 第 10 孔 加 1： 16 的阴性对照血清50 111,第 11 孔加口蹄疫 0 型阳性对照血清 (1:512) 50 U1；第 12 孔加稀释液50 口 1 (空白对照孔)。 第 1?8 孔和 10?12 孔加口蹄疫诊断液,每孔 25 Pio 如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。若用冻干诊断液，则需提前 7?10 天加人 稀释液(每瓶 51nl )浸泡(在 4?6c 下)，方可使用。 2. 2. 5 振荡混匀 加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡 1 分钟，取下放在白纸上, 观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。 2. 2. 6 静置 振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温下静置 1.5?2 小时，或次日判定结果。 2.3 结果判定 2.3 1 先观察对照孔,第 10 孔(阴性血清对照孔)、第 12 孔(稀释液对照孔) 应无凝集现象，呈小圆点状(一 %以上的血球产生凝集，即( + + ) 50 孔(阳性血清对照孔)应有 11 第 2. 3. 2. (阳性反应， 2.3.3 在对照孔合格的情况下，观察的第 1?8 孔，以红血球呈“ + + ”凝集的 待检血清的最大稀释度为其抗体效价。例如，第 1 排的第 3 孔出现“ + + + + ” 凝集 (90?100%红血球发生凝集)，第 4 孔呈“ + + + ”凝集 (75%凝 集)，第 5 孔呈“十十”凝集，第 6 孔呈“ + ”凝集，则判定该份血清中的口 蹄疫抗体效 价为 1： 64 (第 5 孔)。 2 . 4 抗体效价与抗感染的关系：口蹄疫 0 型抗体 1： 128 以上为免疫合格。 3 .屠宰品中口蹄疫病毒检测 3. 1 材料准备 1 .1.1 器材：高速冷冻离心机、普通离心机、组织匀浆器、旋涡振荡器、V 型(1350) 96 孔微量反应板、微量振荡器、盐水接头、 8 号注射针头(磨成平口)、橡胶乳 头。 3 .L2 健康成年家免血清： 62° 。水浴 30 分钟灭能，冻结保存。 4 .L3 口蹄疫 A, 0, C, Asia— I 四型的红细胞诊断液及标准抗原，由中国农业 科 学院兰州兽医研究所生产，按说明书使用。 5 .L4 被检材料的采取、 输送和保存： 在肉联厂、 屠宰场等地采取材料， 以采取 淋 巴结和脊髓为主。每种样品 3?5 克，装入小瓶置冰瓶中送往试验室。试验室 收 到材料后,立即向小瓶内装入被检材料 4?5 倍量的50%甘油、 pH7. 6 的 0. 05mol/L 磷酸一缓冲液(配制法见附录 B) 置一 2 0C 保存，并详细记载材料名称、 来源、 采集时间、地点及保存条件。 6 .1.5 试验用乳鼠：每个样品应准备一窝 10 只 2?3 日龄吮乳小白鼠并带母鼠。 3. 2 操作方法 3. 2. 1 被检材料的处理： 3.2. L 1 取 1 克左右的淋巴结和脊髓等，分别用 pH7.6 , 0. 05mol/L的磷酸缓 冲 液洗二次，用灭菌滤纸吸干，剥去被膜，称取 0.5 克。每 20 份样品随机混合 为 一份混合样品,加少许石英砂研细,加pH7.6, 0.05mol/L磷酸缓冲液89ml, 制成 1： 10 悬液，再加人 10000 单位/亳升的青霉素、链霉素 1 亳升，置 4c 冰 箱过夜。 3.3. L2 三氯三氟乙烷 (F—H3) 处理：将 3 .2.L 1 中制备的悬液,以 8000r/min 4c 离心 30 分钟。取上清液置组织匀浆器的搅拌缸中，加人20%