DB53_T 1082-2022高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程.docxVIP

ICS 65.020 53CCS B 15 53 云 南 省 地 方 标 准 DB53/T 1082—2022 高粱花叶病毒RT-PCR 检测技术规程 2022 2022 - 05 - 20 发布 2022 - 08 - 20 实施 云南省市场监督管理局??发 布 DB53/T 1082 DB53/T 1082—2022 前 言 本文件按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。 本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC 07）归口。本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。 本文件主要起草人：李婕、黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。 I I DB53/T 1082 DB53/T 1082—2022 DB53/T 1082—20225.2 RT-PCR 试 剂 DB53/T 1082—2022 5.2 RT-PCR 试 剂 Oligo (dT)18 引物（0.5 μg/μL），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2×EasyTaq PCR SuperMix 聚合酶混合物。 5.3 引 物 5.3.1 上 游 引 物 SrMV-F ： 5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′ ， 下 游 引 物 SrMV-R ： 5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。 5.3.2 用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为 20 μM 的水溶液。 高粱花叶病毒 RT-PCR 检测技术规程 范围 本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设 置、检测方法和结果判定等。 本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV 高粱花叶病毒（Sorghum mosaic virus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属 （Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghum mosaic virus，缩写为SrMV， 参见附录A。 3.2 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。 4 仪器与耗材 仪器 主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。 耗材 无核酸酶（Nuclease-free）的1.5 mL和2.0 mL离心管及0.2 mL PCR管等。 5 试 剂 5.1 常规试剂 液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70% 乙醇、异丙醇、无水乙醇等。 1 5.3.3 目的扩增片段约为 820 bp。 电泳缓冲液的配制 按以下步骤配制电泳缓冲液： 称取 242 g 的 Tris，先用 300 mL 的 ddH2O 搅拌溶解后，加 100 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液配制 50×TAE 储存液； 用 ddH2O 将储存液稀释 50 倍配制 1×TAE 工作液； 称取 Tris108 g、硼酸 55g、7.44 g 的 Na2 EDTA·2H2O，加入 40 mL 0.5 mol/L 的 EDTA 水溶液， 再用 ddH2O 定容至 1 000 mL 配制 10×TBE 储存液； 用 ddH2O 将储存液稀释 20 倍配制 0.5×TBE 工作液。 扩增产物电泳检测试剂 1% 1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。 6 检测样品的取样及对照设置 阳性对照 以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。 阴性对照 以健康植物样品作为阴性对照。 空白对照 以灭菌ddH2O作为空白对照。 取样 戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污 染。 将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80 ℃冰箱保存备用。 7 检测方法 7.1 总 RNA 提取 总RNA提取步骤如下： 2 戴一次性手套称取 0.