补充2蛋白质理化性质.pptxVIP

第五章蛋白质的通性、纯化和表征.≤目的要求≥1、掌握蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、熟悉蛋白质分离纯化的一般原则，掌握蛋白质分离纯化方法。3、掌握蛋白质的含量测定与纯度鉴定。≤重点难点≥1、蛋白质的两性电离、胶体、沉淀的性质。2、蛋白质的分离纯化方法。.一、蛋白质的酸碱性质1. 蛋白质分子的可解离基团蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质所带电荷性质取决于可解离基团的种类和数目以及溶液的pH。 2. 等电点：使蛋白质分子所带的正电荷与负电荷恰好相等，净电荷为零的溶液pH。（与AA相同）. 每种蛋白质都有特定的等电点，这是鉴别蛋白质的指标之一。等电点和蛋白质分子中所含氨基酸的种类和数目有关。蛋白质的酸性氨基酸和碱性氨基酸含量与等电点的关系:.3. 等离子点蛋白质的等电点在有中性盐（Ca2+，Mg2+，Cl-，SO42-）存在下可以发生明显的变化。等离子点：蛋白质在没有其它盐类干扰的纯水中，蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的溶液的pH值。等离子点是一个特征常数 .二 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （一）胶体性质蛋白质溶液中，蛋白质分子的直径介于1～100nm，该分散系统为胶体溶液系统。布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。胶体系统保持稳定的三个因素 颗粒大小在1～100nm范围内颗粒表面带有同种净电荷与水形成水化层..（二）蛋白质的沉淀 当破坏了维持蛋白质胶体稳定的因素甚至蛋白质的构象时，蛋白质就会从溶液中析出的现象称为蛋白质的沉淀。应用:(1)蛋白质分离纯化(2)解毒(3)临床检验.. 引起蛋白质沉淀的原因1、加入脱水剂以除去它的水化层。2、改变溶液的pH达到蛋白质的等电点使质点失去携带相同净电荷。3、加入电解质破坏双电层，蛋白质分子就会凝集成大的质点而沉淀。+酸碱－－++－－碱酸++－－－++－带正电荷的蛋白质在等电点的蛋白质带负电荷的蛋白质脱水作用脱水作用脱水作用+－++－－+碱酸+－－+－++－－带正电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒带负电荷的蛋白质 蛋白质的聚沉水化层蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图.使蛋白质沉淀的方法(1) 盐析法( salting out)——向蛋白质溶液中加入大量中性盐使蛋白质沉淀称为盐析。常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等盐离子与水的亲和力极强，可脱去蛋白分子表面的水化层；盐离子中和蛋白分子表面的电荷，最终蛋白质聚集沉淀。作用原理:特点：不破坏蛋白质的构象，蛋白质不发生变性。.(2) 有机溶剂沉淀法 原理:使蛋白质脱去水化层，又能降低溶液的介电常数，增强异性电荷间的相互作用而使蛋白质分子聚集沉淀。甲醇、乙醇、丙酮常用有机溶剂:缺点：常会使蛋白质变性 必须在低温下操作注意事项:尽量缩短处理的时间 及时将蛋白质中残存的有机溶剂除去.(3) 重金属盐沉淀法原理:重金属离子如Cu2+、Hg2+、Ag2+、Pb2+等带有正电荷，能与蛋白质分子中带负电的基团结合，生成不溶性的重金属蛋白盐而沉淀。若溶液pH大于蛋白质的pI，沉淀更易发生缺点：常使蛋白质变性失活。.(4) 生物碱试剂和某些酸类沉淀法 原理:生物碱试剂(如鞣酸、苦味酸、钨酸等)，某些酸类(主要是指三氯醋酸、磺酰水杨酸和硝酸等)与带正电的蛋白质结合生成不溶性的盐而沉淀。常引起蛋白质变性缺点：反应溶液的pHpI，确保蛋白质以阳离子形式存在 注意事项:.（5）加热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速。原理： 1、蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 2、破坏电荷情况.. 三 蛋白质分离纯化的一般原则（一） 纯化的目标 （二） 蛋白质分离纯化的一般原则 .（一）目标 蛋白质在生物体中一般都是以复杂的混合物形式存在，在实际工作中，要研究或应用某种蛋白质，必须将其分离提纯到一定的水平。◆ 研究蛋白质的分子结构、组成和某些物理化学性质，需要纯的均一的甚至是晶体的蛋白质样品；◆ 研究活性蛋白质的生物功能，不但需要把样品提纯到一定的水平，而且样品还要保持它的天然构象，要尽量避免因变性而失活；◆ 在制药工业中，需要把某些具有特殊功能的蛋白质提纯到规定的标准，特别是要把一些具有干扰或拮抗性质的成分除去。.（二）一般原则 1、总目标 （1）增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity）即增加单位蛋白质重量中目标蛋白质的含量或生物活性；（2）并且使目标蛋白质的产量达到最高值。.2、分离提纯的一般程序 含有目标蛋白质的动植物组织、细胞或微生物体 前处理 可溶性蛋白质混合物抽提液 粗分级分离已除去大量杂质的蛋白质浓缩液 细分级分离高纯度的