免疫共沉淀详细顺序.pdfVIP

精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互 作用被保留了下来。如果用蛋白质X 的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋 白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的proreinA预先结合固化在argarose的bead 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，bead 上的proreinA就能吸附抗原达到 精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定 一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋 白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天 然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白 质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者 在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗 体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验试剂 1.RIPABuffer配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集） 精心整理 NP-40 （非离子去污剂，提取蛋白；用H O 配制成10%储存液） 2 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H O 配制成10%储存液；避光保存） 2 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使 酶变性，导致活性丧失。 RIPA 蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM 的储存液，室温保存） EDTA （钙螯合剂；用H O 配制成100mM 的储存液，PH7.4） 2 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H O 配制成1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存） 2 抑蛋白酶肽（Aprotinin ）（用H O 配制成1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存） 2 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml 的储存液，分装，-20℃保存） RIPA 磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na VO （用H O 配制成200mM 的储存液，见 3 4 2 SodiumOrthovanadateActivationProtoco） NaF （200mM 的储存液，室温保存） 注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂 2.工作液配制： 配制100ml 的modifiedRIPAbuffer： 1)称取790mg 的Tris-Base ，加到75ml 去离子水中，加入900mg 的NaCl，搅拌， 直到全部溶解，用HCl 调节PH 值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM 的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存 精心整理 5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑 酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na VO ，NaF 各500μl），但是PMSF 在水 3 4 溶液中很不稳定，30 分钟就会降解一半，所以PMSF 应该在使用前现加，其他抑制 剂成分可以在水溶液中稳定5 天。 各种成分在工作液中的终浓度： Tris-HCl ：50mM，pH7.4 NP-40 ：1% 去氧胆酸钠：0.25% NaCl ：150mM EDTA ：1mM PMSF ：1mM 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂：各1μg/ml Na VO ：1mM 3 4 NaF ：1mM 实验步骤 准备工作： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS 洗涤