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染色质免疫共沉淀(ChIP) 1 2021/7/27 星期二 目录 简介 技术原理 技术流程 应用 优缺点 2 2021/7/27 星期二 一、简介 DNA与蛋白质相互作用研究 3 2021/7/27 星期二 一、简介 ChIP 是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达关系。 4 2021/7/27 星期二 二、原理 在活细胞状态下固定蛋白质—DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合物，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片段的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 5 2021/7/27 星期二 三、技术流程 具体操作流程 6 2021/7/27 星期二 1、甲醛交联细胞 具 体 步 骤 7 2021/7/27 星期二 2、染色质超声断裂 1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min.每1min颠倒摇动一次离心管。 2.把DNA粉碎为长度200-1000bp，置于冰上。不同样本都进行超声条件优化实验。 3.14000rpm离心10min（4℃），转移上清于1.5ml离心管。 8 2021/7/27 星期二 3.免疫沉淀蛋白和DNA复合物 ？ ？ 9 2021/7/27 星期二 4、收获免疫复合物（抗体-蛋白质-DNA） 40μlProtein A/G Agarose Beads 1000rpm,离心5min,4℃ a 低盐洗脱溶液1ml洗一次 b 高盐洗脱溶液1ml洗一次 c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次 d TE溶液(pH8.0)1ml洗两次 每次洗时，在摇床上摇10min,4℃，4000rpm离心5min 弃上清 10 2021/7/27 星期二 5、洗脱免疫复合物 11 2021/7/27 星期二 6、去除甲醛交联 ①加5mlNaCl使用NaCl终浓度为0.2mol/l ②阴性对照+350μlChIP洗脱溶液+16μl 5mol/l NaCl。 ③65℃,过夜,去交联。 12 2021/7/27 星期二 7、DNA纯化 ①酚/氯仿抽提 实验样本(600μl) 50μl阴性对照 10μlRNase √ √ 50μl蛋白酶K √ √ 等量酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） √ √ 12000rmp离心5min 上清液 上清液 1/10体积3mol/l乙酸钠 √ √ 2倍体积冰冻无水乙醇 √ √ 13 2021/7/27 星期二 8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和蛋白质在DNA上结合位点的鉴定 (1)如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。 (2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。 14 2021/7/27 星期二 四、应用 组蛋白修饰研究 转录调控分析 药物开发研究 有丝分裂研究 DNA损伤与凋亡分析 15 2021/7/27 星期二 五、优缺点 优点：充分反映生理条件下DNA与蛋白质相互作用的真实情况，可以找出生理条件下某个DNA结合蛋白与DNA序列的结合位点，从而反映体内基因表达调控的真实情况。 缺点：需要一个特异性蛋白质抗体，有时难以获得；为了获得高等丰度的结合片段，必须实验演示胞内条件下靶标蛋白质的表达情况；调控蛋白质的基因获取可能需要限制在组织来源。 16 2021/7/27 星期二 谢谢大家！ 17 2021/7/27 星期二