原生质体制备和转化课件.pptxVIP

Company Logo 培养基成分 高渗溶液（有机/无机） 缓冲液的pH（5.8-7.4） 酶解条件（时间/各种酶的比例） 酶液用高盐还是高渗缓冲液配 擦镜纸收集菌丝体or离心收集菌丝体 双层or单层培养基 Company Logo 《微生物学实验教程》 周德庆（酵母） 1、接种于液体培养基上培养。 2、取培养液10ml，4000r/min离心5min, 弃上清液，用Tris-HCl(pH 7.4)、0.5mol/LEDTA、高渗缓冲液各洗涤一次。 3、用含10mmol/L巯基乙醇的高渗缓冲液稀释裂解酶液。 4、加酶液，100r/min摇床50-100min酶解。脱壁效果达70%左右即停止酶解。 5、100r/min离心三分钟，去沉淀，取上清。再2000r/min离心10min收集沉淀原生质体。 6、高渗缓冲液洗涤2次，2000r/min离心10min收集原生质体，最终用1ml高渗缓冲液悬浮原生质体。 高渗缓冲液： 蔗糖0.5mol/L, MgCl2 10mmol/L,Tris-HCl(pH 7.4) 10mmol/L Company Logo 1、原生质体混合、PEG助融 2、双层平板：底层10ml的固体培养基（1.2%琼脂），将样品加入5ml融化后的半固体培养基（0.6%琼脂，预保温42℃）中，快速混合，导入铺有底层培养基的平板上。待上层凝固后，置于恒温箱培养 Company Logo 《工业微生物育种学》 施巧琴 吴松刚 *菌丝培养基： 1、葡萄糖蛋白胨培养基 2、PDA培养基（一种普遍用于酵母菌和霉菌计数培养用的培养基，被推荐用于各类食品和饮料中酵母菌和霉菌检测和计数 ） 3、査氏培养基（用于真菌的分离鉴定，霉菌、白色念珠菌、酵母等微生物） *再生培养基：同查氏培养基，其中含NaCl浓度为0.8mol/L Company Logo *缓冲液：磷酸氢二钠-柠檬酸溶液 *高渗溶液：0.6mol/L NaCl溶液 *酶溶液：蜗牛酶、纤维素酶，用0.7mol/L的NaCl配制，G6砂芯漏斗抽滤除菌 Company Logo 取107个/mL的单孢子悬浮液 ，涂布于平板表面的玻璃纸上，培养后用无菌镊子将培养菌丝体的玻璃纸转移并倒复在已配好的酶液内，轻轻抖动玻璃纸，菌丝体散落在酶液中，然后去玻璃纸，酶解，定时取样观察。 （该法收集的菌丝体会十分干净，免去了洗涤、离心等手续，减少对菌丝的伤害和杂菌污染） 酶解1-2h，将培养皿内破碎菌丝体和原生质体混合液用吸管吹吸数次，用G2或G3砂芯漏斗过滤，使原生质体同菌丝体碎片分开，滤液1500-2000r/min离心10min，洗涤去上清，悬浮于同一高渗溶液中。再将含有原生质体的滤液用再生培养基洗涤三次，以清除酶液，然后用保存液悬浮。血球计数板计数，冷藏备用。 双层平板，再生，计算原生质体再生率。 Company Logo 林艳学姐： 挑Aspergillus oryzae P5菌丝于葡萄糖-蛋白胨斜面培养基上培养6~7天，至孢子成黄绿色 取新鲜培养的斜面7支，用20mL无菌水洗下成熟孢子于铺满玻璃珠的三角瓶中，置摇床上150r/min振荡分散30min 经四层无菌镜头纸过滤，制成孢子浓度约为107个/mL的单孢子悬浮液 将上述制得的孢子悬浮液每1mL接种于一瓶盛有50mL菌丝培养基的三角瓶中，于30℃静止培养23~25h 6000r/min，离心10min收集幼嫩的菌丝体 用无菌水洗涤菌丝体，4000r/min，离心5min收集菌丝体 用PBA溶液洗涤菌丝体两次，每次4000r/min，离心5min收集菌丝体 Company Logo 以0.15g湿菌体用酶量1mL的比例，加入酶液，置于灭菌平板中 置33℃摇床上80r/min振荡酶解，每半小时取样，在显微镜下观察原生质体的释放情况 待酶解完全后，加等体积1mol/L山梨醇溶液，用四层无菌镜头纸过滤，除去未酶解的菌丝体残片，收集原生质体液 4000r/min室温离心10min，收集原生质体沉淀 去上清，沉淀用1mol/L 山梨醇溶液洗涤2次，每次4000r/min离心10min 弃上清将原生质体悬浮于5mL 1mol/L 山梨醇溶液中，-70℃冰箱冷冻保存备用 Company Logo 将制备好的原生质体溶液3200r/min，4℃离心10min； 弃上清，沉淀重悬于预冷的STC溶液中，将原生质体浓度调整为5×106 ~ 5×107个细胞/mL； 将约2~5µg质粒DNA(体积不超过10µL)与100µL米曲霉原生质体置冰上轻轻混匀； 加入25µL PTC溶液，冰浴20min； 加入1 mL PTC溶液，室温放置15min； 最后加入2mL STC溶液，混匀。 将适量上述转化液涂布于高渗再生基本培养基上，30℃培养5~