《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定.ppt

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《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 生物化学与分子生物学实验教学中心 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 * 内 容 实验目的 1 实验原理 2 实验材料 3 实验过程 4 5 注意事项 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验目的 1.掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法 2.掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法 3.掌握离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法 4.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法 5.了解柱层析技术 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验流程 盐析法进行粗分离 DEAE纤维素离子交换层析 粗提 脱盐 纯化 醋酸纤维素薄膜电泳 鉴定 葡聚糖凝胶G-25层析 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验原理 蛋白质的分离和纯化是研究蛋白质化学及其生物学功能的重要手段。 不同蛋白质的分子量、溶解度及等电点等都有所不同。利用这些性质的差别,可分离纯化各种蛋白质。 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 蛋白质的理化性质与常用的分离纯化方法 蛋白质的理化性质 常用的纯化方法 分子质量 透析、超滤 凝胶层析★ 离心 溶解度 调整pH 调整离子强度★ 降低介电常数 电荷 电泳★ 等电聚焦 离子交换层析★ 特异结合部位 亲和层析 其他性质 吸附层析 液相层析 气相层析 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 球 蛋 白 ?1 ?2 ? ? 等电点 相对分子量(×104) 含量(%) 4.88 6.9 57~67 5.06 20 2~5 5.06 30 4~9 5.12 9~15 6.2~12 6.85~7.3 15.6~30 12~20 血清蛋白的等电点、平均分子量及正常含量 清蛋白 A 在pH6.5溶液中,清蛋白解离而带负电荷, 同时?1、?2、?-球蛋白也会解离而带负电。 由于清蛋白的等电点、分子量最小所以解离而带的负电荷量最多。 ?-球蛋白的等电点高于pH6.5所以解离而带正电荷。 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 实验材料 样品:人混合血清 试剂: 葡聚糖凝胶G-25(Sephadex G-25)层析柱 二乙基氨基乙基(DEAE)纤维素离子交换层析柱 饱和硫酸铵溶液 各不同浓度的pH6.5醋酸铵缓冲溶液 20%磺基水杨酸溶液 1%BaCl2溶液 pH8.6巴比妥缓冲溶液 氨基黑10B染色液、漂洗液 器材:层析柱、电泳仪、电泳槽等 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 1. 粗提原理-盐析法 盐析法:在蛋白质溶液中,加入无机盐至一定浓度, 或达饱和状态,可使蛋白质在水中溶解度降低,从而 分离出来。 水化膜减弱、消失。蛋白质溶液中加入中性盐后, 由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白 质分子周围的水化膜减弱乃至消失。 蛋白质表面的电荷大量被中和。中性盐加入蛋白 质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷 大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,蛋白质分 子之间聚集而沉淀。 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 粗提-盐析法 由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同,故盐析所需的盐浓度也不一样。 调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 血清清蛋白 球蛋白 半饱和硫酸铵 清蛋白不沉淀,上清 球蛋白沉淀,蒸馏水溶解 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 2. 脱盐原理-凝胶层析 盐析分离的蛋白质溶液中含有大量无机盐,必须先脱盐后才能进一步纯化。 脱盐有多种方法,本实验采用凝胶层析法。 凝胶层析法主要是根据混合物中各种物质分子大小的不同而将其分离的技术。 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 凝胶层析分离示意图 蛋白质分子大,无机盐分子小。通过凝胶层析即可将大小不同的物质分离开来。 《生物化学与分子生物学》血清清蛋白、g-球蛋白的分离、提纯与鉴定 3.纯化原理-离子交换层析 离子交换层析是指流动相中的离子和固定相上的离子进行可逆的交换,利用化合物的电荷性质及电荷量不同进行分离。 R-SO3-H+ + Pr+ R-SO3-Pr+ + H+ 阳离子交

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