威尼德分子杂交仪：Western blot 实验介绍(原理 方法步骤 试剂小结.docxVIP

威尼德分子杂交仪：Western blot实验原理及试验步骤 威尼德生物科技(北京)，研发生产的：经济型分子杂交仪VH-1000、 多功能型分子杂交仪VH-4000、组合型分子杂交仪VH-2000,底部标配培养皿圆 周运动托盘，选配250ML/500ML锥形瓶托盘，96孔酶标板托盘，可适用于如 放置杂交袋等其他严格要求的孵育实验，，以及膜洗脱和凝胶脱色，同时可以做 恒温微生物培养。分子杂交仪是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑 料杂交袋和水浴摇床，并防止破损带来的污染危害。 经典实验步骤是将提取的蛋白电泳—转膜——抗孵育-二抗孵育一一一 底物显色分析。我这几天几乎都在重复着这个过程，现在将自己试验过程记 录下来，和大家一起提供，希望对新手有所帮助。 .蛋白提取 传统方法是(1)组织称重(2)利用液氮、研钵粉碎组织块(3)加入RIPA缓冲 液，PMSF(4)匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃(5)加入PMSF冰上孵育30分 钟，移入离心管4c离心15分钟(6)上清液为细胞裂解液可分装-20C保存。一 局部进行Bradford比色法测定蛋白质浓度，取相同质量的细胞裂解液(体积* 蛋白质浓度)进行电泳。 小结 现在有许多公司提供即用的蛋白提取试剂或者试剂盒，如生兴生物 代 理的Pierce系列产品，针对不同动物组织、真核等蛋白的提取试剂盒，以及RIPA 缓冲液，PMSF等即用型试剂，免去了复杂繁琐的提取过程，高效方便。 .蛋白电泳(SDS) ⑴SDS凝胶配制 SDS凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用现成的SDS凝胶配制试剂盒 （2）样品处理 在提供的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS蛋白上样缓冲液（2X或5X 的）。可以自行配制。 （3）上样与电泳 这一步主要是要注意电泳的电压选择和蛋白标准的选择，为了便于观察电泳 效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小，最好使用预染蛋白质分子量标准。 3 转膜 具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要 的转膜口寸间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。实验中常选用 PVDF膜和硝酸纤维素膜（NC膜），但硝酸纤维素膜比拟脆，推荐使用PVDF膜。 转膜的效果用丽春红染色液或者考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的 SDS胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。 小结 PVDF膜 及Western转膜液质量都比拟好，染色液的染色结果清晰, 便于观察结果，所以推荐在试验中使用。 威尼德生物科技（北京），研发生产的:经济型分子杂交仪VH-1000、 多功能型分子杂交仪VH-4000、组合型分子杂交仪VH-2000,底部标配培养皿圆 周运动托盘，选配250ML/500ML锥形瓶托盘，96孔酶标板托盘，可适用于如 放置杂交袋等其他严格要求的孵育实验一以及膜洗脱和凝胶脱色，同时可以做 恒温微生物培养。分子杂交仪是现代实验室采用杂交技术的理想设备，可替代塑 料杂交袋和水浴摇床，并防止破损带来的污染危害。 4.封闭 这一步一定要保湿，防止膜的干燥，否那么极易产生较高的背景。加入Western 封闭液封闭（脱脂奶粉 或者BSA）。一般采用BSA或者脱脂奶粉，建议最好使用 BSA或专用的脱脂奶粉进行封闭，虽然贵点，但还是有个好点的结果比拟好。 5. 一抗孵育 参考一抗的说明书，按照适当比例用Western 一抗稀释液稀释一抗.二抗孵育 参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物 酶（HRP）标记的二抗。 . Westernblot试剂盒显色及蛋白检测 参考相关说明书，使用相应的荧光检测试剂等ECL类试剂来检测蛋白。洗 片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂 盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。 8.展的重复利用；［=j 8. 展的重复利用 ；［=j 如果蛋白样品非常珍贵，可以使用Western 一抗二抗去除液处理蛋白膜，以 重复利用蛋白膜。 9.分析比拟记录主要试剂：丙烯酰胺和N, N。亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠SDS溶液、浓 缩胶缓冲液、TEMED原溶液、SDS加样缓冲液、Tris-甘氨酸电泳缓冲液、 转移缓冲液、丽春红染液储存液、脱脂奶粉、NaN3 0.02%叠氮钠、Tween20. 一抗、标记二抗、NBT、BCIP、100mmol/LTris-HCL(pH9.5) lOOmmol/L NaCl、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5) 5mmol/LEDTA 等。