大肠杆菌蛋白提取方法.docxVIP

大肠杆菌周质蛋白提取 大肠杆菌周质蛋白提取 提取胞周质蛋白，渗透压破壁的方法是经典也好用的办法。步骤如下： 1、离心收集菌体，8000rpm/3~5min； 2、PBS 重悬菌体，洗涤 2 次，离心条件同上； 3、30%蔗糖（1 克菌体至少 20ml）重悬菌体，放置 10 分钟； 4、离心收集菌体，离心条件同上； 5、纯水重悬菌体（1 克菌体至少 20ml），放置 10 分钟； 6、离心，条件同上，小心移出上清即为提取液；如果不清亮，再 15000rpm/10min 离心一次。 注意事项：蔗糖和水悬浮时间长，则可能菌体全部破碎；而时间短了，则可能提取不完全。同理，离心力太大离心时间长，可能造成菌体完全破碎。 上面说的条件，是指台式小离心机，如果处理的样品多，使用大的转头或连续流转头，则适当考虑离心力的换算，同时考虑加速/减速比较慢而适当调整离心时间。 提取液测定 260/280 吸收值，再走电泳，应该能够初步判断提取的效果。260 很高、杂蛋白很多，则破菌过分了。 以冰冻的 20% 蔗糖、 2.5 mM EDTA、20 mMTris-HCl (pH 8.0)重溶诱导细胞，浓度达到 5OD550 单位/ml，冰浴 10 分钟。 15000g 离心 30 秒，取出沉淀再重溶于同样体积的冰冻的 2.5 mM EDTA，20 mMTris-HCl，pH 8.0。冰上静置 10 分钟。注意