基因测序 课件.pptVIP

过渡页 第一部分 第二部分 第三部分 第四部分 . * DNA双螺旋1953 中心法则1958 PCR 1983 DNA重组技术1974 遗传密码1966 DNA是遗传物质 1952 1950 2000 1990 1980 1970 1960 2010 第一台自动测序仪1986 毛细管电泳测序仪1996 荧光ddNTP第一台商用自动测序仪1987 化学降解法和sanger 1977 3700 1998 * 第一代基因测序技术 1977年桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基 在2001年，完成的首个人类基因组图谱就是以改进了的Sanger法为其测序基础 1.1975年由（Sanger）和（Coulson）开创的双脱氧链终止法 2.1977年吉尔伯特（Gilbert）发明的化学法（链降解） 3.在sanger法基础上发展而来的各种DNA测序技术 * Sanger法的原理 1.使用带有放射性同位素的ddNTP来终止DNA合成反应 2.高分辨率变性凝胶电泳以及放射自显影确定DNA序列 核心原理： 1.测序长度可达1000bp 2.准确性高，几乎100% 3.通量低，成本高，耗时长，不适合大规模应用 特点： Sanger法核心原理 * 第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用,如人类基因组计划(human genome project,HGP)主要基于第一代DNA测序技术。目前基于荧光标记和Sanger的双脱氧链终止法原理的荧光自动测序仪仍被广泛地应用。 随着人类基因组计划的完成,人们进入了后基因组时代,即功能基因组时代,传统的测序方法已经不能满足深度测序和重复测序等大规模基因组测序的需求,这促使了新一代DNA测序技术的诞生，即第二代测序技术。 * 第二代基因测序技术 核心原理：边合成边测序（SBS） 基本步骤：文库制备—单克隆DNA簇的产生—测序反应 * 具代表性的第二代测序平台： 1.荧光标记 -美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA） -瑞士Roche 公司的454 -美国ABI 公司的寡聚物连接检测测序（sequencing by oligo ligation detection， SOLiD） 第二代基因测序技术 2.PH变化 -美国Life Technologies 公司的Ion Torrent个人化操作基因组测序仪(PGM） * Illumina测序平台 美国Illumina 公司的基因组测序仪（genome analyzer，GA） Illumina的Solexa和Hiseq是目前全球使用量最大的第二代测序机器 主要技术点： 1.可逆终止的荧光标记dNTP 2.边合成边测序 * Illumina测序平台测序原理 文库构建 SBS测序 桥式pcr Flowcell 测序原理（来自illumina官网） * Illumina测序平台核心部件 测序流动槽flowcell：吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——在flowcell上进行DNA簇的生成，测序。 Flowcell实物图 * Flowcell表面示意图（来自illumina官网） 每个泳道(Lane)内的上下两个表面随机的布满了能够与文库两端接头分别互补配对的寡核苷酸(P7和P5接头)。这两种接头与泳道表面共价连接。 Flowcell表面微观示意图 * DNA文库制备 A A T T 片段化DNA 末端补平 3’加A： 加一个A 接头连接 A 完成文库构建 * DNA模板杂交和一链合成 5’-3’ 延伸 接头序列 含有P7和P5两种接头 的FlowCell表面 2.以杂交的单链DNA为模板，FlowCell上的接头为引物， 合成第一链 1.单链DNA分子与FlowCell表面的对应接头杂交 * 双链DNA变性 变性 冲走模板链 新和成的链留在flowcell上 * 桥式PCR的扩增 单链DNA与FlowCell表面对应接头杂交，形成“桥” 以接头为引物进行扩增 扩增完成形成双链的桥 * 双链DNA变性 变性 得到与FlowCell相连的两条互补的单链DNA分子 * 待测链形成 完成数十次循环的桥式PCR 变性：双链“桥”变性为单链 P5上的切割位点 切割并冲走与P5接头相连的那条DNA链 将测序引物杂交到文库的接头上，并且封闭3‘-OH端 * SBS测序 特异荧光标记的4种dNTP，3’-OH叠氮基团被保护，每次只能添加一个dNTP，这就确保了在测序过程中，一次只会被添加一个碱基，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。