基因工程 第6章 基因文库的构建与目的基因的获得.pptVIP

第一链的合成 在1.5ml离心管中，按顺序加入以下试剂： 10×first strand buffer 5.0μl First strand Methyl Nucleotide mixture 5.0μl Linker-primer(1.4μg/μl) 2.0μl DEPC water 30.5μl RNase Block Ribonuclease Inhibitor(40u/μl) 1.0μl * . 振荡混匀，然后加入5μl（5μg）mRNA,混匀。 室温放置10分钟，以便模板和引物退火。 加入3.5μlMMLV-RT(20u/μl),终体积50μl，混匀，稍离心。 取出5ｕL放于含有0.5ｕL α-32P dATP的离心管做对照反应。 37℃温育1小时同时准备16℃水浴。 将第一链反应液取出，放置在冰上 * . 第二链的合成 在冰上按顺序往第一链反应液中加入以下试剂： 10×Second strand buffer 20.0μl Second strand dNTPs 6.0μl ddH2O 108.2μl α-32P dATP 2μl 稍混匀，离心后加入RNase H（0.9u/μl） 3.5μl DNA polymerase I(9.0u/μl) 11.1μl 迅速振荡管子以混匀，稍离心后，在16℃温育2.5小时，然后取出放在冰上。 注意：在操作过程中必须保证温度不超过16℃，否则会引起发夹结构的形成，影响cDNA的克隆。 * . cDNA第一链和cDNA第二链碱变性琼脂糖凝胶电泳的同位素X光片 * . cDNA第一链和双链cDNA凝胶电泳 * . cDNA末端的补平 在反应管中加入Bluting dNTP mix 23μl pfu DNA polymerase (2.5u/μl) 2.0μl 混匀后，72℃温育30 分钟，注意：不能超过30分钟。 取出反应管，加200μl苯酚：氯仿（1：1）抽提。 12000rpm室温离心2分钟，取上清，用等体积氯仿再抽提1次。 取上清，加入20μl 3M NaAc(PH5.2)，400μl无水乙醇，-20℃过夜沉淀。 12000rpm，4℃，离心60分钟。 70%乙醇洗沉淀，吸出乙醇后，干燥沉淀。 将沉淀溶于9.0μl的EcoR I adapters溶液中。4℃放置至少30分钟，使cDNA完全溶解。 * . EcoR I adapters的连接 在含有cDNA和EcoR I adapters的管中加入 10×Ligase buffer 1.0μl 10mM rATP 1.0μl T4 DNA ligase(4μg/μl) 1.0μl 4℃连接两天，将管放在70℃水欲中30分钟，以灭活连接酶。 * . EcoR I 末端的激活 在反应管中加入 10×Ligase buffer 1.0μl 10mM rATP 2.0μl 灭菌水 6.0μl T4 polynucleotide kinase10μg/μl) 1.0μl 37℃温育30分钟。 70℃温育30分钟以灭活T4 polynucleotide kinase1，稍离心。 * . . 第六章 基因文库的构建与目的基因的获得 * . 基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA