临床样本的采集、运输和保存及核酸提取.pptVIP

RNA提取实验前的准备 【使用器具】 尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，则使用0.1%DEPC水溶液在37℃处理12h，后120℃高压30min，去除残留DEPC 【试剂配制】 无菌水须用0.1%DEPC处理后高温高压灭菌 RNA实验试剂应RNA提取专用，避免其他试剂交叉污染 【其他】 实验过程中使用一次性手套，并经常更换；在RNA专用区操作，操作过程中避免交谈… … 第六十二页，共六十八页。 表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法： 每mg组织中加入1mlTrizol试剂，高速破碎组织（使用高速组织捣碎器） 加入氯仿0.2ml,轻轻颠倒混匀，室温静置分层。 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 吸上清液至新离心管中，约600ul 加入500ul异丙醇，混匀，室温静置10分钟 高速离心12000rpm，4-8 °C ，10分钟 弃上清液，沉淀为RNA 加入1mlDEPC处理的75%乙醇，混匀，7500rpm离心， 4-8°C，5分钟 加入DEPC处理水30ul，混匀，55-60 °C水浴 3ul加入297ulDEPC水，测定浓度和纯度 第六十三页，共六十八页。 异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法 第六十四页，共六十八页。 试剂的作用： 加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活 第六十五页，共六十八页。 （四）、mRNA的分离纯化 除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3′末端带有长短不同的poly（A）尾巴 利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA 第六十六页，共六十八页。 The End! 第六十七页，共六十八页。 内容总结 临床标本的采集、处理、运送与保存及DNA/RNA提取。所有标本的采集、运送和处理应在无菌操作，防止污染的原则下进行。每μg核酸标本中加入0.1U的肝素，即可100%的抑制酶活性。做血红蛋白电泳常温1周，电泳4℃可保存15天。5、核酸的贮存——DNA保存。4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。核酸的贮存——RNA保存：。.R蛋白质复合物，使蛋白质变性。蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能。苯酚溶于有机溶剂，微溶于水。DEPC水制备：0.1%DEPC在37°C处理1h，并高压灭菌15min。裂解时间至4-5分钟，并且裂解过程中宜适当偶尔摇动以促进红细胞裂解。The End 第六十八页，共六十八页。 三、基因组DNA的分离与纯化 第三十页，共六十八页。 （一）、DNA样品准备 常见的标本： 血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等 生物组织： 最好新鲜组织，若不能马上提取，应贮存 － 70℃或液氮 第三十一页，共六十八页。 DNA提取前样本采集、预处理和保存： 全血 抗凝剂： EDTA-Na2 或枸橼酸钠 作为抗凝剂 不宜使用肝素 抗凝剂处理血 肝素 柠檬酸* EDTA* -80℃ 保存2个月，第10天收率90% 4 ℃ 第四天收率90% 第10天提取效果差 第十天收率85% 室温 提取效果差 第四天收率90% 第十天提取效果差 第三十二页，共六十八页。 （二）、DNA提取 （一）酚抽提法： 先用EDTA、 SDS 、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。 第三十三页，共六十八页。 酚 抽 提 法 提 取 步 骤： 第三十四页，共六十八页。 DNA酚抽提法示意图 第三十五页，共六十八页。 主要试剂的作用： EDTA：1. 二价金属螯合剂，抑制核酸酶； 2. 降低细胞膜的稳定性 第三十六页，共六十八页。 SDS的作用： 1. 溶解膜蛋白和脂肪，从而使细胞膜破裂 2. 溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸 释放出来 3. 对RNA、DNA酶有抑制作用 4. 与蛋白质形成R-O-SO3 ….R蛋白质复合物，使蛋白质变性 第三十七页，共六十八页。 蛋白酶K： 水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质 蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能 力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可 同时使用 第三十八页，共六十八页。 苯酚： 蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性 苯酚溶于有机溶剂，微溶于水 提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率 氧化苯酚会破坏DNA 第三