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离子交换高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的核苷酸 　　摘要：本研究运用离子交换高效液相色谱法对婴幼儿奶粉中的5种核苷酸进行了同时测定，结果表明，5种待测核苷酸在各自的浓度测定范围内线性关系良好（相关系数r20.999），方法检出限为0.9～2.0mg/kg，加标回收率为78.2%～113.4%，相对标准偏差小于5%。因此得出结论，该方法灵敏度高、定性干扰少、定量准确，可满足对婴幼儿奶粉中核苷酸检测的要求。 　　关键词：离子交换高效液相色谱奶粉核苷酸 　　1引言 　　核苷酸（nucleotide）是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖，以及磷酸这3种物质组成的化合物，又称核甙酸，其对婴幼儿免疫功能、肠道功能、睡眠、脂类代谢、体格生长等方面起着重要作用[1]。奶粉中补充外源性核苷酸有助于改善人体肠道菌群、维持肠道的形态学及功能、促进生长发育、提高免疫力等，因此近年来一些国家陆续允许将核苷酸添加到婴幼儿奶粉中[2]。我国于2005年开始正式允许将核苷酸作为营养强化剂添加到婴幼儿配方食品中，主要包括胞嘧啶核苷酸（cmp）、腺嘌呤核苷酸（amp）、尿嘧啶核苷酸（ump）、鸟嘌呤核苷酸（gmp）、次黄嘌呤核苷酸（imp）等。《食品安全国家标准食品营养强化剂使用标准》（gb14880-2012）规定，核苷酸作为婴幼儿配方食品中的食品营养强化剂时允许使用量为0.12g～0.58g/kg（以核苷酸总量计）。本实验使用阴离子交换高效液相色谱法对上述5种核苷酸进行了同时测定，希望建立一种灵敏度高、干扰少、定量准确的测定方法，进而满足相关部门对婴幼儿奶粉中核苷酸检测的要求。 　　2材料与方法 　　2.1仪器与试剂 　　仪器：高效液相色谱仪（e2695），美国waters公司;s220型ph计，瑞士mettler-toledo公司;超纯水纯化系统，美国millipore公司。 　　试剂：胞嘧啶核苷酸（cmp）、腺嘌呤核苷酸（amp）、尿嘧啶核苷酸（ump）、鸟嘌呤核苷酸（gmp）、次黄嘌呤核苷酸（imp）标准物质，美国stanfordchemicals公司;甲醇（色谱纯），德国默克公司;冰乙酸、乙酸铵（分析纯），国药集团。 　　混合标准储备液配制：分别称取核苷酸标准品cmp、amp、ump各10mg、gmp和imp各5mg，用超纯水溶解转移至同一个100ml容量瓶中，纯水定容至刻度。此标准溶液浓度为：cmp、amp、ump各100μg/ml，gmp、imp各50μg/ml。 　　2.2试验方法 　　2.2.1样品前处理 　　称取混合均匀的固体试样约5g（精确至0.1mg）置于100ml锥形瓶中，加入20ml热水（50～60℃）充分溶解试样，冷却至室温。用10%（v/v）醋酸溶液调试样溶液ph值至4.1后，将溶液移入50ml容量瓶中，定容，滤纸过滤，所得滤液用0.45μm微膜过滤备用。 　　2.2.2液相色谱条件 　　色谱柱：agilentzorbaxsax（4.6mm×250mm，5μm）;流速：1.0ml/min;柱温：30℃;进样量：10μl;流动相（梯度流脱）a：50mmol/l磷酸二氢钾水溶液，流动相b：甲醇;梯度：0～25min、40%～100%a，25.0～25.1min、100%～40%a，25.1～30min、40%a。 　　3结果与分析 　　3.1液相色谱条件的选择 　　核苷酸是一类极性较大的化合物，当采用《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中核苷酸测定》（gb5413.40-2016）方法中的c18-t反相色谱柱进行分析时，很难达到较好的保留和分离，目标化合物的检测也存在杂峰干扰，影响定量。标准方法采用的流动相含有离子对试剂，长期使用不仅对色谱柱的损害较大，还会影响色谱柱的使用寿命。本实验通过将试样溶液的ph值调节为弱酸性，适当增加了溶液中的氢离子活度，促进了核苷酸的电离反应，使其在水溶液中呈离子状态，从而适用于离子交换分离模式，更可用离子交换色谱柱进行有效分离。 　　在流动相的选择上，本试验考察了不同ph值和不同浓度的磷酸二氢钾溶液对分离效果的影响。结果发现，ph值越小、分离越差，原因应为流动相酸度过大时，氢离子抑制了核苷酸的电离和流动相的电离，进而降低了洗脱能力。当流动相ph值大于5时，核苷酸显现多种电离形式，出现多于待测核苷酸种类的峰型，使分析变得困难。同时，流动相的洗脱能力会随流动相浓度的增大而增强。因此，实验需根据色谱柱的实际使用情况，优化流动相浓度以达到合适的保留时间，并保证足够的分离度。通过优化，本试验选择ph值为4.1的50mmol/l磷酸二氢钾水溶液作为流动相，通过梯度洗脱程序