(4.4.1)--4.4脱毒苗的鉴定.pdfVIP

脱毒苗的鉴定 通过不同脱毒方法获得的植物材料必须经过严格的病毒检测，证明其体内确实不含有要 脱除的病毒，才是真正的脱病毒苗，方可在生产上应用。 脱毒苗鉴定的方法主要有：指示植物病毒鉴定法、抗血清鉴定法、分子生物学方法等。 1.1 指示植物病毒鉴定法 指示植物病毒鉴定法是最早应用于病毒检测的方法，早在1929 年美国的病毒学家霍姆 斯 （Holmes）用感染马铃薯花叶病毒（TMV）的普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂混合，然后 在烟叶子上摩擦，一段时间后叶片上出现了局部坏死斑。每种植物病毒都有一定的寄主范围， 并在某些寄主上表现特定的症状，借此可作为鉴别病毒种类的标准。对某种或某几种病毒即 类似病原物或株系具敏感反应并表现明显症状的植物称为指示作物。这种病毒鉴定方法就叫 指示植物检测法。 常用的指示植物有草本和木本两类。一种理想的指示植物具备的特质是：能快速生长； 具有适宜接种的大叶片，且能在较长时间保持对病毒的敏感性，易接种。在较广范围内具有 同样的反应。可作为病毒检测的指示植物有千日红、曼陀罗、野生马铃薯、黄花烟、心叶烟 和豇豆等。 用草本指示植物检测植物病毒通常采用汁液涂抹法（图7-4 ），即通过外力在指示植物 体表面（如叶片）造成微小伤口使病毒从伤口进入植物细胞引起被接种植株发病的方法。 具体操作如下：被鉴定植物上取几片幼叶，在研钵中加少量水及等量pH7.0 的0.1mol/L 磷酸缓冲液，研碎后用两层纱布滤去渣滓，再在汁液中加入少量的500～600 目金刚砂作为 摩擦剂，取汁液在指示植物叶面上轻轻涂抹，轻轻摩擦，使叶面造成小的伤口进行接种，5min 后用清水冲洗叶面。接种时可用手指涂抹、或纱布、或喷枪等来进行。接种后将指示植物放 在半遮蔽、温度为20℃～25℃条件下，定期观察并记录指示植物症状，根据其症状的有无 即可判断待检测样品是否带有已知病毒。 汁液涂抹法病毒鉴定 此外，有些草本植物如草莓病毒还可以采用嫁接接种法检测（图7-5 ）。取待测植物（如 草莓）幼嫩的成叶，切去左右两片小叶，把中间小叶削成带有1～1.5 厘米叶柄（叶柄切面 成契形）的接穗；同时，除去指示植物上中间的小叶，在叶柄的中央部分切一个1～1.5 厘 米的契形口，插入接穗，包扎接合部。罩上聚乙烯塑料袋或放在喷雾室内保湿培养。若接穗 染有病毒，则在接种后1～2 个月，在新展开的叶片、匍匐茎或老叶上出现病症。每一指示 植物可嫁接2～3 片待测叶片，此法可全年进行。 草莓指示植物小叶嫁接检测法示意图 1．取待检草莓叶，去两侧小叶，留中央小叶，保留叶柄长约1.5cm 削皮层成楔形 5-3 ．从盆栽生长良好指示植物上挑选健全 叶片，剪去中央小叶 6．用封口膜(parafilm)缠绕包扎嫁接部位 7 ．用喷雾器向植株喷少许清水,用开有小孔的塑料袋将指示植 物罩上,移回防虫网室置散射光下，10d 后去塑料袋 (熊庆娥,2000) 木本植物种类较多，所感染的病毒各异，所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物。 经过试验和筛选，目前国际上各类植物病毒都有一套通用的木本指示植物。 木本多年生果树等植物采用汁液接种法比较困难，通常采用嫁接传染法。以指示植物作 砧木，被鉴定植物作接穗，可采用双重芽接法 （图7-6 ）、双重切接法 （图7-7 ）。双重芽 接法是对苹果软枝病检测中创立的方法，是检测木本植物病毒最主要的方法。指示植物病毒 检测法在检测中具有观察的直观性，且要求的条件简单，操作方便，成本低；目前仍在广泛 使用。其缺点是灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类，不能测出病毒总的核蛋白浓度， 而只能测出病毒的相对感染力。 1.2 抗血清鉴定法 植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白，是一种抗原，给动物注射后会产生一种免疫 球蛋白，称为抗体。抗体主要存在于血清中，故含有抗体的血清为抗血清。不同病毒刺激动 物产生的抗体均有各自的特异性。因此，根据已知的抗体与未知的抗原能否特异结合形成抗 原-抗体复合物的情况，可判断是否携带病毒。由于植物病毒抗血清具有高度的专化性，感 病植株无论是显症还是隐症，均可通过血清学的方法准确地判断植物病毒的存在与否、存在 部位和存在数量等。在植物病毒血中能定性、定量的快速检测，所以，抗血清法是病毒检测 中最为常用和有效的检测手段之一。 抗血清鉴定法要进行抗原的制备，包括病毒的繁殖、病