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综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分 切割DNA的金属配合物 指导教师：毛宗万 黄华珍 cesmzw@ huanghuazhen@ 中山大学化学与化学工程学院 2009年10月 /ChemEdu/Echemi/comlab/index.htm 实验3 功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征 模板合成 IR光谱表征 自由基的UV光谱检测 实验4 功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像 总学时：15 学时 地点：丰盛堂218室 实验内容 Ⅰ 超螺旋DNA Ⅱ 缺刻型DNA Ⅲ 线型DNA 自由基机理 自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏 酯水解机理 亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应 酯水解机理优于自由基机理 DNA结构及其断裂方式 配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂 进一步在新的断裂处结合 断裂反应 互补链的断裂 DNA的自由基断裂 实验背景——模拟博莱霉素 在天然物质中，由5 个氨基酸、2 个六碳糖和1 个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。 导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。 CuP-3A的配位结构示意图 博莱霉素的活性中心 Pamatong, F. V.; Detmer. C. A., III; Bocarsly, J. R.; J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 5339. Detmer. C. A., III; Pamatong, F. V.; Bocarsly, J. R.; Inorg. Chem., 1996, 21, 6292. 博莱霉素的模型化合物 Cu2+ + e- = Cu+ Cu+ + H2O2 = Cu2+ + OH- + ?OH am andhe mand ffjr ggt rbrwb 氨基酸铜化合物的合成路线 模板反应的化学机理 化合物1的红外光谱 ?(COO-) ?(COO-) ?(NO2) ?(NO2) 化合物2的红外光谱 ?(COO-) ?(COO-) ?(NH2) 氢氧自由基的形成和UV光谱检测 由于罗丹明B可与HO·迅速反应，并在553nm有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO·的生成。 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖 低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等 凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围 琼脂糖浓度(%) 线型DNA分子的分离范围(Kb) 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.9～6 1.5 0.2～3 12.0 0.1～2 电泳缓冲液 常用三种缓冲液 Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE) TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀 TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解 核酸电泳的指示剂 指示剂：溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当 琼脂糖凝胶浓度 0.6% 1% 1.4% 2% 迁移率 1Kb 0.6Kb 0.2Kb 0.15Kb 琼脂糖凝胶浓度 1% 1.4% 迁移率 2Kb 1.6Kb 核酸电泳的染色剂——溴化乙锭 一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光 可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min 琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng 溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察 ethidium bromide，EB 电泳实验装置 电泳仪（普通） 电泳槽（水平平板） 灌胶模具等 电泳实验方法 洗净电泳槽，架好梳子 配制琼脂糖凝胶及倒胶 上样与通电 结果观察 配制琼脂糖凝胶及倒胶 0.5×TBE电泳缓冲液10